ИФА метод

Иммуно-ферментный анализ является популярным методом обнаружения вирусов в растениях из-за его простоты и широкой применимости. Используемый в основном для подтверждения наличия или отсутствия инфекции, он может быть адаптирован для оценки концентрации антигена, например вирусного капсидного белка, в соке растений.
Иммуно-ферментный анализ основан на специфическом связывании вирусных белков с антителами и молекулярной гибридизации на связывании вирусных нуклеиновых кислот с ДНК- или РНК-зондами, специфичными для последовательности, благодаря комплементарности их последовательностей. Эти процессы связывания визуализируются прикрепленными маркерами на основе флуоресцентных красителей, ферментов, вызывающих различные реакции радиоактивности или других факторов Иммуноферментный анализ применяется для диагностики вирусов с любой формой вирионов. Используется для выявления вирусов, бактерий, грибов в растениях. По сравнению с серологическими методами иммунодиагностики вирозов, ИФА имеет более высокую чувствительность, превосходя их на 2–3 порядка. При этом для идентификации вируса требуется минимальное количество сока, всего несколько миллиграмм. Диагностические методики, основанные на ИФА, существуют благодаря двум фундаментальным открытиям: Антитела, нековалентно связанные с твердым носителем, и ферменты, ковалентно связанные с антителами или антигенами, не теряют биологическую активность. Таким образом, иммобилизованные антитела продолжают связывать антигены, а связанные ферменты способны расщеплять субстраты. Конъюганты антител с ферментами обладают высокой чувствительностью и специфичностью по отношению к антигенам. Они способны распознавать и избирательно связывать тот антиген, против которого они были получены. Каждая молекула антитела несет только одну молекулу фермента. При этом фермент катализирует превращение десятков и сотен тысяч молекул субстрата. Это способствует зафиксировать наличие гомогенного антигена даже при незначительных его количествах.
Принцип методик ИФА Иммуноферментный анализ основан на адсорбции антител, специфичных для определенного вида вируса на пластиковых планшетах с 96 углублениями-лунками.Применяется ИФА в нескольких различных модификациях. Ознакомимся с «сэндвич»-методом, общая схема которого выглядит следующим образом[1]: В углубления-лунки пластикового планшета добавляется раствор антисыворотки[1]. Производится инкубирование в течении 1 часа при +37ºС или при +4ºС в течение ночи[1]. Неадсорбированные антитела отмываются и в лунки добавляется сок исследуемого растения. Присутствие вируса в соке приводит к его реакции с адсорбированными антителами и возникновение связи с планшетой[1]. Производит ещё одна инкубация и отмывка[1]. В лунки добавляется конъюгант (раствор, содержащие антитела, связанные с ферментом). Обычно используют следующие ферменты: щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена. При наличии вируса наблюдается его связывание с ферментом[1]. Проводится третья инкубация в течение двух часов про +37ºС и промывка для удаления несвязанного конъюганта[1]. В ячейки добавляется энзимный субстрат (хромоген). Его вид зависит от использованного фермента. В частности, если в качестве фермента используется щелочная фосфатаза, то субстратом служит n-фенилнитрофосфат. Если ферментом была пероксидаза, то – 5-аминсалициловая кислота или ортофенилендиамид[1]. Проводится ещё одна инкубация и измеряется активность энзима. Количество реагента прямо пропорционально количеству вируса. Интенсивность его окраски пропорциональна концентрации вируса[1].
Процедура проведения ИФА вполне проста. Для каждого конкретного вируса доступны планшеты для ИФА. Каждая лунка планшета содержит прикрепленные к ее сторонам специфичные для вируса антитела. В лунку добавляют сок или жидкость, извлеченную из ткани или клеток. Чтобы свести к минимуму возможные чрезмерные или нежелательные реакции, а также для титрования вируса, жидкость можно разбавить в несколько раз буфером. Если вирус присутствует в тестовой жидкости, он свяжется со своим антителом. Лунки промывают для удаления жидкости и ее содержимого, которое не связывалось и, следовательно, не являлось целевым вирусом. Добавляется больше того же антитела, связанного с лункой. Этот второй набор антител также имеет прикрепленный к нему фермент, который вступает в реакцию с пигментом. Эти антитела прикрепляются к вирусам, удерживаемым связанным антителом. После этой второй реакции все незакрепленные антитела смываются. И сейчас, добавляется пигментный субстрат. Если субстрат прикрепляется к ферменту из-за его присутствия, он изменит цвет. Изменение цвета означает, что целевой вирус присутствует в соке или тканевом экстракте, и если никаких изменений не происходит, значит, вирус отсутствует.
Преимущество ИФА заключается в том, что метод может быть адаптирован для использования в полевых условиях, также он экономически выгоден в использовании, весьма чувствителен к вирусам. Главный недостаток заключается в том, что даже, если подходит для вирусов, ИФА метод недостаточно чувствителен к бактериям.