использование спектрофотометрического метода для опредения витамина А

Содержание

ВВЕДЕНИЕ        

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ        

ГЛАВА 1        

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР        

«Витамин А как модулятор физиологических процессов. Современный подход к определению жирорастворимых витаминов»        

1.1.Открытие и химическая структура витамина А        

1.2.Физиологическая роль витамина А        

1.3. Каротин, ретинол и свободные радикалы        

1.4.Методы определения жирорастворимых витаминов        

ГЛАВА 2        

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ        

2.1. Материалы и оборудования        

2.2. Спектрофотометрическое определение жирорастворимых витаминов        

2.3 Построение градуировочного графика        

2.2.1 Определение содержания жирорастворимых витаминов в тканях мозга белых крыс        

Выводы        

Библиографический список        

ВВЕДЕНИЕ

В организме человека витамины играют огромную роль, участвуя во всех физиологических процессах. Даже, несмотря на то, что небольшая часть витаминов может синтезироваться нашим организмом, все же витамины являются незаменимыми пищевыми компонентами. Расход их увеличивается в различных стрессовых ситуациях, при увеличении физической нагрузки, в ходе развития заболеваний различной этиологии, а также в условиях ухудшения экологической обстановки. Все эти неблагоприятные факторы могут нарушать биологические равновесия, иначе говоря, гомеостаз. Контроль за содержанием витаминов в пищевых продуктах, витаминных препаратах является одной из важных задач практической химии. Не менее важным и в практическом и теоретическом плане является определение биологически активных веществ в тканях и биологических средах организма. Проблема дефицита витамина А остро стоит во всем мире. Поэтому для исследования нами был выбран ретинол ацетат играющий колоссальную роль в жизнедеятельности организма. Сказанное определило цели и задачи нашего исследования.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основной целью нашей работы было исследовать возможность спектрофотометрического определения витамина А в разных объектах, в том числе в биологических (плазма крови и ткани мозга белых крыс в норме, при воздействии сероводородсодержащим газом Астраханского месторождения, а также при введении альфа-токоферола и синтетического антиоксиданта эмоксипина гидрохлорида).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Проработать литературу по вопросу значения, применения и определения жирорастворимых витаминов, в частности каротиноидов и витамина А.

2. Отработать методику спектрофотометрического определения ретинола ацетата, подобрать оптимальные условия омыления липидной фракции, мешающих определению витаминов и каротиноидов, подобрать условия экстрагирования ретинола ацетата. Снять спектры полученных гексановых экстрактов с целью выяснения оптимальной длины волны.

3. Выяснить диапазоны концентрации ретинола ацетата, при которых соблюдается закон Бугера-Ламберта-Бэра. Построить и рассчитать градуировочный график.

4. Провести определение ретинол ацетата в плазме крови и тканях мозга интактных и опытных белых крыс.

5. Проанализировать полученные результаты и сделать выводы о возможности определения ретинол ацетата в биологических объектах и о влиянии сероводородсодержащего газа, экзогенных антиоксидантов на содержание жирорастворимого витамина в тканях мозга и плазме крови животных.

ГЛАВА 1

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

«Витамин А как модулятор физиологических процессов. Современный подход к определению жирорастворимых витаминов»

1.1.Открытие и химическая структура витамина А

Витамины - сложные органические соединения, обладающие высокой биологической активностью, содержащиеся в пищевых продуктах в очень небольшом количестве, но являющиеся жизненно необходимыми компонентами пищи. В организме человека витамины играют роль своеобразных регуляторов и катализаторов. Даже, несмотря на то, что небольшая часть витаминов может синтезироваться нашим организмом самостоятельно при условии рационального, правильного и сбалансированного питания, все же витамины являются незаменимыми пищевыми компонентами. Кроме этого следует отметить тот факт, что наш организм не создает так называемого резерва витаминов (за исключением витаминов А, Д и В12, которые на некоторое время запасаются в печени, однако требуют постоянного пополнения), поэтому витамины должны поступать в организм постоянно и в нужных количествах.В зависимости от обеспеченности витаминами принято выделять такие состояния организма, как авитаминоз, гиповитаминоз и гипервитаминоз [1].

Авитаминоз- это специфическое нарушение обмена веществ, вызванное длительным отсутствием (дефицитом) какого-либо витамина в организме, которое приводит к определенному заболеванию или гибели организма.

Гиповитаминоз - это состояние организма, связанное с недостаточным (сниженным) количеством витаминов в организме. Проявляется оно в быстрой утомляемости, понижении работоспособности, остроты зрения в темноте, шелушении кожи, снижении сопротивляемости организма инфекционным заболеваниям.

Гипервитаминоз - это нарушение биохимических процессов и функций вследствие избыточного (длительного) поступления в организм витаминов. Гипервитаминозы характерны для жирорастворимых витаминов, особенно А и Д, которые могут накапливаться в жировых депо организма. Поэтому следует принимать витамины микроциклами.

Витамины разделяются на две группы: жирорастворимые (А, Д, Е и К) и водорастворимые (С, Р, Н, витамины группы В и др.) [2].

Витамин А был открыт двумя независимыми группами ученых Мак-Коллут -Девис и Осборн. Стал первым из открытых витаминов, поэтому его соединение стало обозначаться буквой А в соответствии с алфавитной номенклатурой. В дальнейшем было установлено, что имеется три витамина группы А: ретинол, или витамин А1, неоретинол – стереоизомер  А1 и А2. Этот витамин необходим не только животным, но и человеку, и при его дефиците у человека проявляются заболевания глаз – ксерофтальмия и гемеролапия. Витамины группы А содержатся только в животных продуктах, таких, как печень, рыбий жир, сливочное масло и др. В растительной пище содержатся каротиноиды, способные предупреждать А-авитаминоз. При поступлении в организм человека или животных они под влиянием фермента каротиназы превращаются в витамин А1. Ретинол представляет собой непредельный одноатомный спирт, состоящий из ß-ионового кольца, а также боковой цепи, содержащей два остатка изопрена и первичную спиртовую группу:

Ретинол растворим в метаноле, этаноле, хлороформе. Разрушается под действием УФ-света, легко окисляется на воздухе, устойчив к действию щелочей, неустойчив в кислой среде [3].

Витамин А2 отличается от ретинола наличием дополнительной двойной связи в β-иононовом кольце [4].

В организме ретинол легко окисляется при участии специфических ферментов с образованием активных производных – ретиналя  и ретиноевой кислоты. Активной формой витамина А является ретиналь.

        Ретиналь                                ретиноевая кислота

Витамин А и его производные существует в организме в транс-конфигурации, за исключением сетчатки глаза, где они могут находиться в виде 11-цис-ретинола и 11-цис-ретиналя [5]. Содержание витамина А в некоторых распространенных продуктах питания приведено в табл.1.1.

Все формы витамина А хорошо растворимы в жирах, а также в бензоле, хлороформе, эфире, ацетоне и других жирорастворителях. Ретинол разрушается под действием этанола, при освещении ультрафиолетовыми лучами, под влиянием кислорода воздуха, высокой температуры, а также при наличии в жирах продуктов окисления жирных кислот [6].

Таблица 1.1.

Содержание витамина А в некоторых продуктах питания [4].

1.2.Физиологическая роль витамина А

Витамин А оказывает влияние на развитие молодых организмов, состояние эпителиальной ткани, на процессы роста и формирования скелета, ночное зрение. Так, адаптация зрения к условиям различной освещенности длится около 8 минут при нормальных запасах витамина А и 30—40 минут — при уменьшении их наполовину. Витамин А участвует в нормализации состояния и функции биологических мембран.

В сочетании с витамином С он вызывает уменьшение липоидных отложений в стенках сосудов и снижение содержания холестерина в сыворотке крови.

Особенно витамин А нужен щитовидной железе, печени и надпочечникам. Он один из витаминов, сохраняющих молодость. Например, он продлевает жизнь подопытным животным.  Особенно много витамина А в печени морских животных. Вот почему препараты из печени этих животных (например, «катрэкс» — из печени черноморской акулы катрана) очень ценны.

Нехватка витамина А может привести к ушным инфекциям и отразиться на механизме слуха. Его с большим успехом применяют в аллергической терапии [7]. Установлено, что приступ сенной лихорадки можно полностью отразить принятием 150000 ME витамина А. Зарубежные врачи называют его «первой линией обороны от болезней», так как целостность покровов и эпителия внутри тела, нормальная их работа — первое условие здоровья.

Основной "фронт", где витамин А ведет борьбу с инфекциями - это слизистые оболочки. Ведь именно слизистые оболочки являются основной мишенью для инфекций. Ретинол играет существенную роль в формировании эпителиальной ткани, входящей в состав кожи, желез и слизистых оболочек, выстилающих органы дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов. Этим клеткам витамин А необходим особенно, для нормального продуцирования слизи и защитных иммунных факторов[8]. Каротины повышают защитную силу собственных интерферонов. Витамин А защищает от свободных радикалов чувствительную зобную, или вилочковую железу, которая представляет собой штаб-квартиру иммунной системы. Эта маленькая железа, находящаяся за грудиной, с возрастом постепенно утрачивает свои функции. Витамин А, как уже доказали иммунологи, может улучшать работу зобной железы, а кроме того, повышать количество белых кровяных телец - лейкоцитов - стражей иммунной системы. Поэтому витамин А необходим часто болеющим детям и пожилым людям с ослабленным иммунитетом, так как инфекционные заболевания истощают запас этого витамина. Таким образом, витамин А поддерживает местный иммунитет жизненно важных органов.

При попадании вредных частиц на слизистую оболочку дыхательных путей, защитный слой эпителиальных клеток начинает вырабатывать слизь, которая защищает эпителий от высыхания. Слизь способствует выведению этих частиц вверх и наружу - при кашле и чихании. Таким образом, витамин А предупреждает проникновение в организм воздушным путем вредных частиц и микробов. Дополнительное обогащение рациона питания витамином А снижает опасность инфекций дыхательной системы[9].

Благодаря защитному воздействию на слизистые оболочки и эпителиальные клетки пищеварительного тракта, витамин А оказывается полезным дополнением при лечении некоторых болезней кишечника (например, колита и болезни Крона), а также язвы двенадцатиперстной кишки. Ученые из Гарвардского университета обнаружили, что при достаточном употреблении витамина А риск возникновения язвенной болезни значительно уменьшается [10].

Витамин А играет важную роль в синтезе прогестерона - женского полового гормона. Он наиболее необходим женщине во второй фазе менструального цикла, после овуляции (с 14 по 28 день цикла). При воздействии этого витамина некоторые из беспокоящих симптомов предменструальной напряженности исчезают [11].

Для мужчин витамин А - необходимый кофактор продуцирования здоровой спермы.

Витамин А - источник дополнительного питания кожи. Он способствует своевременному обновлению клеток кожи и их нормальному функционированию. Поэтому витамин А эффективно используется в комплексном лечении многих кожных заболеваний [12].

Наиболее широко известная функция витамина А - профилактика заболеваний глаз. Витамин А играет решающую роль в процессах световой и темновой адаптации. Ретинол при каждом световом возбуждении участвует в синтезе зрительных пигментов сетчатки глаза - родопсина и йодопсина, которые и регулируют адаптацию глаза к свету и темноте, а также цветное зрение. Особенно важно это для людей, подолгу работающих у компьютера, глаза которых постоянно подвергаются контрастным световым вспышкам [13]. Кроме того, витамин А способствует увлажнению роговицы глаза, а при его дефиците возникает опасность воспаления слизистой оболочки глаза - конъюнктивита, и даже хронической сухости глаз - ксерофтальмии.

Для выживания индивида животные должны обладать способность обнаруживать свет, а также различать свет различных длин волн. С этой целью в ходе биологической эволюции у них развились фоторецепторные органы — глаза, в которых центральную роль играют поглощающие свет фоторецепторы, или зрительные пигменты. Наиболее эффективно способность реагировать на свет используется у животных. В связи с этим в данной главе нельзя не остановиться на особенностях процессов фоторецепции и зрения, которые будут рассмотрены на примере работы зрительной системы человека [14].

Сетчатка глаза человека содержит рецепторные  клетки двух типов — палочки и колбочки. Палочки отличаются большой светочувствительностью: всего пяти квантов света достаточно, чтобы вызвать нервный импульс. Палочки предназначены для зрения при малой освещенности и дают черно-белую картину. Колбочки обеспечивают  цветовое зрение. Существует три вида колбочек — чувствительные к синей, зеленой или красной областям спектра. Хромофором, воспринимающим свет в палочках сетчатки, является хромопротеин родопсин, или зрительный пурпур. Опсиновый белок в действительности является сложным комплексом собственно белка — опсина, липидов и углеводов, но термин «опсин» применяют как к белковой части, так и к комплексу в целом. Опсины, выделенные из сетчатки многих видов животные представляют собой небольшие белки с молекулярной массой порядка 30 000—40 000. Почти у всех представителей животного мира зрительные пигменты и качестве хромофора содержат 11-цис-ретиналь (витамин А1); распространение 3,4-дегидроретиналя (витамин А2) ограничивается рядом пресноводных рыб и некоторыми видами земноводных. Родопсин находится в мембранных структурах - дисках, которые располагаются в палочке. Мембранные  диски на 80% состоят из родопсина, молекулы которого «пронизывают» мембрану насквозь.

В родопсине 11-цис-ретиналь ковалентно связан с опсином путем образования шиффова основания (альдимина) между его альдегидной группой и ε-аминогруппой лизинового остатка олеина. Чрезвычайно важное значение имеют также нековалентные взаимодействия между боковыми группами остатков аминокислот белка и π-электронной системой пол иенового фрагмента, которые, во-первых, определяют конформацию хромофора в составе родопсина, а во-вторых, вызывают поляризацию π-электрон ной системы полиенового фрагмента. Энергетические характеристики нековалентных взаимодействий между опсином и полиеновой цепью зависят от структуры белка и cопряженных с ним липидов и углеводов и существенно различаются для различных родопсинов. Именно эти эффекты совместно с индукционным эффектом, возникающим от образования альдиминной связи, обусловливают:  1) значительный сдвиг в красноволновую область максимума поглощения 11 -цис-ретиналя в составе родопсина (λmax« 500 нм) в сравнений с  альдегидом в свободном состоянии (λmax« 375 нм);   2) вариации величины  λmах у разных зрительных пигментов. Все это приводит к повышению чувствительности светового и цветового восприятия. Цветовое зрение человека — это трихроматический процесс, за который ответственны рецепторы, чувствительные к разному цвету — синему (λmax=440 нм), зеленому (λmах - 535 нм) и красному (λmax575 нм) — и содержащие различные  пигменты. Различие в λ,max поглощаемого света обусловлено особенностями строения опсина и нековалентных взаимодействий опсин — хромофор.  Все детали структуры и функций фоточувствительных пигментов  в настстоящее время еще не выяснены до конца, но установлено, что в основе механизмов функционирования зрительных пигментов заложены многостадийные циклические процессы.

При попадании света на сетчатку происходит изомеризация 11-цис-ретиналя в 11-транс-ретиналь за счет энергии поглощенного света.

        11-цис – ретиналь                                        11 – транс - ретиналь

В результате взаимодействия между полиеновой системой и белком нарушаются, следствие чего легко и необратимо расщепляется альдиминная связь, и альдегид освобождаеися в транс-форме (11-транс-ретиналь):

Родопсин + hv → Опсин +транс-Ретиналь

Родопсин имеет красный (пурпурный) цвет, который ему придаст цис-ретиналь; транс-ретиналь практически бесцветен. Поэтому при освещений родопсин обесцвечивается. Такой эффект можно наблюдать, если поместить сетчатку лягушки или кролика сначала в темноту, а потом осветить: в темноте сетчатка становится красной, а при освещений обесцвечивается за несколько минут.

Последующая регенерация родопсина, т.е. связывание альдегида с опсином требует превращения 11-транс-ретиналя в 11-цис-ретиналь. Такое превращение может протекать двумя путями: в темноте и на свету.

 В темноте восстановление родопсина протекает сравнительно медленно и включает в себя стадии перевода:

1. 11-транс-ретиналя в 11-транс-ретинол с участием алкогольдегидрогеназы:

C19 H37 CH=O +НАДФН +Н+→ С19 Н37 СН2 -ОН +НАДФ+

транс-ретиналь                         транс-ретинол

 2) 11-транс-ретионола в 11-цис-ретинол;

    3) 11-цис-ретинола в 11-цис-ретиналь.

Регенерация исходного пигмента на свету протекает довольно быстро с участием ретинальизомеразы через стадию 11-транс-ретиналь→11-цис-ретиналь. Далее цис-ретиналь вновь образует комплекс с опсином – без участия ферментов.

Регенерация родопсина на свету происходит за счет фондов ретинола в пигментном эпителии, обновление которых обеспечивается транспортом ретинола, хранящегося в печени. В экстремальных случаях недостатка витамина А его запасы в печени истощаются и, хотя снабжение сетчатки поддерживается до последней возможности, в конце концов может возникнуть его дефицит. В результате организму не удается регенировать зрительный пигмент и наступает слепота, вначале обратима, а при длительном дефиците ретинола переходящая в постоянную из-за денатурации опсина, нестабильного в свободном состоянии.

Рис.1.1. Схема фотохимического процесса зрения [1].

Витамин А тесно связан с гормоном роста - причиной недостаточного роста ребенка может быть нехватка именно этого витамина. Рост костей в конечностях происходит, главным образом, за счет ростовой зоны (хрящевой прослойки). Именно клетки хрящевой ткани, наиболее активно участвующие в процессе обмена веществ, требуют большого количества витамина А. Молодые клетки костей растут, сохраняют некоторое время активность, а затем отмирают, чтобы уступить место новым хрящевым клеткам. Чтобы этот постоянный цикл в костно-хрящевой ткани детей не прекращался, витамин А контролирует этот ферментативный процесс [15].

Поскольку у костей много общего с зубами, то это касается и прикуса наших малышей. Витамин А укрепляет челюстные кости и предотвращает, таким образом, неправильный прикус. Кроме того, витамин А увеличивает устойчивость десен к инфекциям и воспалениям.

Витамин А защищает организм от онкологических заболеваний пищеварительной системы, мочевого пузыря, легких, кожи. Он способствует подавлению процессов постепенного перерождения здоровых клеток в злокачественные; оказывает лечебно-профилактическое действие при предопухолевых состояниях слизистой оболочки полости рта, желудка и шейки матки. При высоком потреблении каротинов с пищей и, в результате, высокой концентрацией его в крови, риск заболевания раком снижается. Также он сокращает риск рецидива после удаления опухоли[16].

Недостаток витамина А широко распространен. Из-за этого происходит замедление реакции организма. Так, в ФРГ проводились опыты с 152 шоферами, которые или не прошли водительские испытания, или имели наибольший список дорожных происшествий. Им давали ежедневно по 150 000 ME витамина А, что привело, как сообщает Институт психологии транспорта, к значительному увеличению их водительских способностей [17].

Проблема дефицита витамина А остро стоит во всем мире. Производится лечение витамином А. Так, в Индии детям в возрасте 1—5 лет раз в полгода дают по 110 миллиграммов витамина А (200 000 ME, или 40 взрослых норм сразу!). Среди детей, получивших две дозы, заболеваемость глаз сократилась на 75%.

Потребность в витамине А составляет 1,5 мг/сутки, что равняется приблизительно 5000 ME (1 ME=0,3 мг), причем не менее 1/3 потребности должно быть удовлетворено за счет самого витамина А, а 2/3 — за счет ß-каротина [18].

Гипервитаминоз витамина А встречается крайне редко, так как нужны необычайно высокие дозы, поступление которых в жизни трудно осуществить. Уменьшают запасы витамина А алкоголь, канцерогены, висмут; сильное уменьшение в диете белка (с 18 до 3%) уменьшает отложение этого витамина в печени более чем 2 раза. Разрушает его кислород воздуха, кислоты, ультрафиолетовые лучи. Прогорание жиров ведет к разрушению витамина А [19].

Важнейшие источники витамина А: печень, сливочное масло, сливки, сыр, яичный желток, рыбий жир. При тепловой обработке витамин А значительно разрушается.

Превращение каротина в витамин А происходит в стенке тонких кишок и в печени. При недостаточности витамина А появляются следующие симптомы: ослабление зрения в сумерках, воспаление и сухость глаз, шелушение век, чувствительность глаз к блеску или огням; повышение восприимчивости к инфекциям; гусиная кожа" на тыльной стороне рук, сухая, потрескавшаяся кожа; быстрое замерзание; ухудшение аппетита; выпадение и ломкость волос; истончение зубной эмали, боль в костях и суставах, замедление роста; инфекционные процессы верхних дыхательных путей: синусит, гайморит, фронтит;  воспаление мочеполовой системы, жжение и зуд при мочеиспускании [20].

1.3. Каротин, ретинол и свободные радикалы

Свободные радикалы – нестабильные атомы и соединения, действующие как агрессивные окислители и в результате повреждающие жизненно важные структуры организма, а также – активные образователи (молекулы, имеющие неспаренные электроны). Под действием свободных радикалов, прежде всего, образуется такое заболевание, как рак, а также варикозное расширение вен, атеросклероз, болезни сердца [21].

Свободные радикалы ускоряют старение организма, провоцируют неправильное функционирование систем организма, воспалительные процессы во всех тканях, включая нервную систему и клетки мозга. А самое главное – нарушает функцию иммунной системы. В научном мире это называется «пероксидное окисление  липидов», а результат – оксидативный стресс. Свободные радикалы нарушают ДНК (гены), вызывая изменения наследственной информаций и раковые заболевания. Это называется «мутирование клеток»[22].

И витамин А, и β-каротин защищают мембраны клеток мозга от разрушительного действия свободных радикалов, при этом β-каротин нейтрализует самые опасные виды свободных радикалов: радикалы полиненасыщенных кислот и радикалы кислорода.

Под воздействием свободных радикалов происходит цепная реакция повреждения клеток. Витамин А способен подавлять эти разрушительные процессы, ограждая риск сердечно-сосудистых заболеваний, катаракты глаз[23].

В пище витамин А в основном содержится в форме провитаминов. Известны три провитамина А — это α-, β- и γ-каротины (от лат. carota — Морковь), отличающиеся друг от друга по химическому строению и биологической активности. Наибольшую биологическую активность с точки зрения эффективности синтеза витамина А проявляет β-каротин:

                                         β - Каротин

   Каротин — ненасыщенный углеводород, оранжево-желтый пигмент. Поэтому он находится в плодах, листьях цветков, имеющих оранжево-желтый пигмент (окраску) [22].

   β-каротин – Спектр: в гексане λmax 451 и 425 нм; CS2   λmax 520, 485 и 450 нм. Главный каротиноид тканей зеленых растений и корневых морских водорослей. Широко распространен в растениях и животных. Оптически неактивен. SbCl3 в   CHCl3 дает синее окрашивание (λmax 590 нм).

  Обширная группа каротиноидов подразделяется на 2 подкласса: каротины, содержащие исключительно углерод и водород, и ксантофиллы, в состав которых входят также молекулы кислорода (спирты, кетоны, альдегиды, окиси, простые и сложные эфиры). Несмотря на большое разнообразие, все молекулы каротиноидов имеют в своей структуре полиеновую цепь с чередующимися двойными связями. В такой цепи (так же, как в бензольном кольце) наблюдается обобщение электронов, что определяет оптические (поглощение в видимой области спектра) и антиоксидантные свойства данных соединений [23].

   Некоторые свойства каротиноидов. α-каротин - Спектры: в гексане λmax  457, 445 и 420 нм; в CS2   λmax 509 и 477нм. Содержится в листьях и корнях Daucus carota, плодах красной пальмы. Часто сообщают об обнаружении в других материалах, не отличая от геометрических изомеров -каротина. С SbCl3   в CHCl3 дает соединение синего цвета  (λmax 542 нм). Витаминная активность составляет половину активности β-каротина.

α-каротин

   δ-каротин – Спектр: в гексане  λmax 486, 430 нм. Длинные красные иглы из CS2.

   γ – каротин. Спкетр: в Петролейном эфире, λmax 495, 462 (2720) и 431; в CS2 λmax 532, 496 и 463 нм. Содержится в листьях Cuscuta salingJuniperis virginiana, а также  в некоторых плодах, цветах, многих грибах [24].

γ – каротин

  Основными источниками поступления каротиноидов для человека являются овощи и фрукты (табл.1.2).

Таблица 1.2.

Содержание каротиноидов в некоторых фруктах, овощах и ягодах (мг/100г сырого веса) [25].

Часть β-каротина, который не превращается в организме в витамин А, выполняет особые защитные функции. Уже теперь, умеренное и регулярное употребление красной моркови и ее сока можно рекомендовать в качестве фактора, снижающего риск развития преждевременного старения и опухолей. Полагают, что каротин усиливает действие половых гормонов. Содержание в плазме крови человека каротина колеблется от 80 до 230 мг% и зависит от поступления с пищей.

При некоторых заболеваниях, например, экземе, содержание каротина в крови составляет 8—30 мг. В организме человека он откладывается в печени, сердце, нервной ткани, костном мозгу, семенниках, яичниках, коже — особенно в стопах и ладонях.

В виде масляного раствора β-каротин в два раза менее активен витамина А [26].

Исключительно важным фактором усвоения каротина является наличие в кишечнике желчи. Дети усваивают его хуже, чем взрослые. При очень больших дозах искусственного каротина усваивается 1—2%. В отличие от витамина А, каротин в больших дозах нетоксичен и не вызывает гипервитаминоза.

1.4.Методы определения жирорастворимых витаминов

В области изучения витаминов накоплен громадный и разнообразный материал и он свидетельствует о том, что витамины являются органическими соединениями разной химической природы, необходимыми для обеспечения обмена веществ, лежащего в основе всех жизненных процессов. В связи с этим интерес к витаминам со временем не ослабевает, а возрастает еще больше. Особенно важной является разработка методов определения витаминов в различных объектах с целью контроля за их содержанием в продуктах питания, косметических средствах, лекарственных препаратах. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется в качестве стандартного метода определения ряд витаминов.

Эффективным методом, позволяющим обеспечить количественный контроль содержания витаминов в многокомпонентных объектах, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - универсальный аналитический метод разделения и определения компонентов сложных смесей. Метод ВЭЖХ незаменим при анализе термически и химически лабильных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) групп A, D, Е и К. Обычно применяемый вариант нормально-фазового (НФ) разделения синтетических жирорастворимых витаминов. ВЭЖХ основан на элюировании их неполярными органическими растворителями после сорбции на полярных сорбентах (химически модифицированных кремнеземах (ХМК), модифицированных полярными функциональными группами). Однако такой вариант ВЭЖХ не обеспечивает эффективного разделения сложных смесей, с полным набором жирорастворимых витаминов (A, D, Е и К) в пробах с водосодержащей матрицей, так как даже небольшие количества воды могут негативно влиять на воспроизводимость результатов. Такие препараты для НФ ВЭЖХ должны быть предварительно переведены методами щелочного гидролиза в форму, удобную для последующего хроматографирования. При проведении подобных операций изменяется состав биологически активной формы - эфиров. Поэтому определяется только суммарное содержание продуктов гидролиза. Основным методом анализа ЖРВ без изменения их состава может стать обращенно-фазовая ВЭЖХ.

Бумажная и тонкослойная хроматография также применяется для разделения сложных смесей, содержащих биологически активные вещества и идентификации витаминов группы А. Для обнаружения витаминов группы А хроматограмму после выдерживания в течение 20 минут в атмосфере Cl2 опрыскивают свежеприготовленным раствором 380г SbCl3  в 100 мл уксусного ангидрида. Бумагу высушивают прогреванием при 90-100 0С. Пятна на хроматограмме детектируются в УФ–свете по появлению флуоресценции. Чувствительность этого метода 0,5-5мкг.

Трихлорид сурьмы наиболее специфичен (из всех известных) к витамину А. Хроматограмму опрыскивают насыщенным раствором SbCl3 в CHCl3. Витамин А, его эфиры, ретинен и ангидровитамин А дают синюю окраску.

Также для детектирования возможно использование УФ-света. Под действием коротковолнового света (256нм) витамин А флуоресцирует ярким золотисто-коричневым цветом [3].

При определении содержания витамина А в пищевых продуктах, биологических объектах и витаминных препаратах используют также физико-химические, флуориметрический, полярографический и гистохимический методы, а также метод изотопного разведения. Выбор какого-либо метода определяется целью исследования, свойствами анализируемого материала, предполагаемым содержанием витамина А и каротина и характером сопутствующих примесей.

Для количественного определения веществ, обладающих А-витаминной активностью, может быть использован метод прямой спектрофотометрии, основанный на способности этих соединений к избирательному светопоглощению на разных длинах волн в ультрафиолитетовой области спектра. Метод прямой спектрофотометрии наиболее простой, быстрый, достаточно специфичный и дает хорошие результаты при определении содержания витамина А и каротина в объектах, не содержащих примесей, обладающих поглощением в той же области спектра. Если есть мешающие определению вещества, то этот метод может быть использован в сочетании со стадией хроматографического разделения [27].

Высокой чувствительностью и специфичностью обладает метод, основанный на измерении поглощения производного витамина А - гидроретинола, образующегося в присутствии малых количеств минеральных кислот.

Соединениям группы витамина А свойственна способность к образованию окрашенных продуктов реакции при взаимодействии с целым рядом химических веществ: хлоридом сурьмы, трифторуксусной кислотой, глицерин-1,3-дихлоргидрином и др. Наибольшее распространение получил метод определения витамина А по реакции с хлоридом сурьмы - метод Kappa-Прайса. Но недостатком этого метода является неустойчивость развивающейся окраски, затрудняющая определение.

При взаимодействии витамина А с глицерин-1,3-дихлоргидрином образуется более стабильное соединение, сохраняющее постоянную окраску в течение 2-10 минут. Однако, этот метод уступает в чувствительности методу Карра-Прайса: интенсивность окраски образующегося продукта реакции в 5 раз слабее, чем при реакции с хлоридом сурьмы.

Метод с использованием трифторуксусной кислоты интересен тем, что может быть применен для раздельного определения эфиров, спирта, витамина А-кислоты, т.к. окрашенные продукты реакции имеют максимальное поглощение на различных длинах волн. Существует метод определения концентрации витамина А (ретинола) и ретинол-связывающего белка в плазме и печени -это метод жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД), который дает возможность точно, быстро и с высокой воспроизводимостью определять по отдельности различные метаболиты витамина А.

При концентрации витамина А в плазме выше 0,7 мкмоль/л (20мкг/дл) недостаточности его быть не может, но если концентрация ниже 0,7 мкмоль/л, то проявляется недостаточность. На экспериментальных животных применяют непрямой метод определения концентрации ретинола в печени, суть которого заключается в оценке изменения концентрации ретинола в плазме после перорального приема определенной дозы ретинола ацетата

ГЛАВА 2

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Материалы и оборудования

Для решения поставленных задач нами использовано следующее оборудование:

Спектрофотометр ПЭ – 5400В

Водяная баня

Центрифуга

Центрифужные пробирки  10мл.

Этиловый спирт 96%

25%-ный водный раствор аскорбиновой кислоты

10N раствор КОН

Гексан, ч.д.а.

Масляный раствор ретинола ацетата, производитель ООО «Полисинтез», с массовой долей вещества 3,44%. Одна капля масляного раствора содержит 0,9 мг ретинола ацетата.

2.2. Спектрофотометрическое определение жирорастворимых витаминов

Использованная нами методика предназначена для определения жирорастворимых витаминов в биологических тканях.

Пробоподготовка состоит из двух этапов: омыление и экстрагирование. Для этого из образца тканей готовят гомогенат на дистиллированной воде в соотношении 1:3.

В пробирку с подготовленной смесью этилового спирта (1мл) и 25-%-ного водного раствора аскорбиновой кислоты (0,5мл) вносят 1мл полученного гомогената. После предварительного прогрева проб до 700С в течение 5минут, в смесь приливают 1мл 10N раствора КОН и нагревают на водяной бане в течение 30минут при 700С для омыления липидов, мешающих определению витаминов и каротиноидов. По окончании нагрева пробы охлаждают под струей холодной воды, приливают 4 мл гексана, энергично встряхивают до однородной эмульсии в течение 1 минуты, после чего центрифугируют 15 минут при 1000 об/мин.для отделения гексановой фракции, содержащей каротиноиды и витамины [28].

Для оределения ретинола снимают оптическую плотность гескановой фракций при длине волны 328нм.

2.3 Построение градуировочного графика

Градуировочные графики строят, пользуясь эталонными растворами чистых веществ. Для построения графика необходимо приготовить 5 – 10 растворов с различной концентрацией эталонного вещества с таким расчетом, чтобы это число растворов охватило весь интервал, в пределах которого может изменяться концентрация определяемого вещества.

Для построения градуировочного графика использовали масляный раствор ретинола ацетата с массовой долей 3,44 %. Готовили серию растворов с различным содержанием ретинола ацетата. Для этого пипеткой отмеряли масляный раствор витамина в пять пробирок по 1, 2, 3, 4, 5 капель и доводили каждую дистиллированной водой до 1 мл. Таким образом мы получали пробы с концентрацией ретинола ацетата 0,675; 1,350; 2,050; 2,725 и 3,400 мкмоль/см3 . Все дальнейшие операции проводили в соответствии с методикой, которая описана выше.

Все определения проводили в пяти повторах и получали пять серий растворов.

Для уточнения оптимальной длины волны нами предварительно был снят спектр гексанового экстракта. Результаты, полученные опытным путем совпадают с теоретическим. Поэтому оптическую плотность гексановой фракций  определяли при длине волны 328нм.

Таблица 2.1.

Значения оптической плотности для построения градуировочного графика

М(ретинола ацетата) = 328,5г/моль

1 капля ретинола ацетата  - 3000МЕ (0,9мг)

  1 капля = 0,9 мг : 2,7 мкмоль :0,625 мкмоль/см3

  2 капли = 1,8 мг  : 5,4 мкмоль : 1,35 мкмоль/см3

   3 капли = 2,7мг    : 8,2 мкмоль : 2,05 мкмоль/см3

   4капли = 3,6 мг    : 10,9 мкмоль : 2,725 мкмоль/см3

   5 капель = 4,5 мг  : 13,6 мкмоль : 3,4 мкмоль/см3

По полученный значениям оптических плотностей построен градуировочный график

А

С, мкмоль/см3

Рис. 2.1. График зависимости оптической плотности от концентрации.

Калибровочный график описывается уравнением:

,

где y-оптическая плотность, полученная в результате измерений; x-концентрация определяемого вещества в мкмоль/см3.

b=0,65 – 2,04m,

25,46625m + 6,63 – 20,808m = 6,6771

4,66825m = 0,0471

m = 0,01

b=0,629

y=0,01х + 0,629.

По графику видно, что закон Бугера-Ламберта-Бера соблюдается в диапазоне концентраций 0,9 до 4,5 мг  в пробе или 0,675 до 3,4 мкмоль/см3, что позволяет использовать методику для количественного определения ретинола ацетата.

2.2.1 Определение содержания жирорастворимых витаминов в тканях мозга белых крыс

Опыты проводили на лабораторных белых крысах, средней массой 180 – 220г. Животные, как контрольные, так и опытные, получали пищу в последний раз за 12 часов до начала эксперимента. Экспериментальные исследования на животных проводились в осенний период с целью исключения влияния сезонных ритмов. Животные содержались в условиях вивария на стандартном рационе. Перед взятием в опыт они проходили карантин в специальном помещении вивария. Животные с подозрением на спонтанную патологию выбраковывались.

Для исследования использовали плазму крови и ткани мозга белых крыс, которые были разделены на группы:

1 – контроль (без воздействия) 10 животных;

2 – ингаляторное воздействие природным сероводородсодержащим газом в дозе 150 мг/м3 по H2S (экспозиция 240 минут). Затравку производили в течении 6 недель, 5 дней в неделю (понедельник-пятница); 10 животных;

3 – введение per os в течение 14 дней (за две недели до декапитации) 5% масляного раствора D,L,α – токоферол ацетата в дозе 1 мг/100г массы тела; 10 животных;

4 – введение внутримышечно в течении 14 дней (за 2 недели до декапитации) 1% раствора эмоксипина в дозе 0,5 мг/100г массы тела; 10 животных.

Декапитацию животных осуществляли под хлоралгидратным наркозом. После декапитации собирали кровь в пробирки, обработанные гепарином, центрифугировали и отбирали плазму для анализов.

Мозг препарировали, выделяя на холоде следующие отделы: большие полушария, промежуточный, средний, продолговатый отделы, мозжечок, спинной мозг. Выделенные препараты мозга помешали в индивидуальных пакетах с маркировкой в морозильную камеру до проведения исследований.

В день измерений готовили на фосфатном буфере гомогенаты тканей мозга перечисленных отделов. Для этого отвешивали 250 мг ткани, измельчали ее ножницами до кашицеобразной массы и гомогенизировали растиранием в фарфоровой ступке. Все операции с биоматериалом проводили в кратчайшие сроки. Полученный гомогенат доводили дистиллированной водой до объема 1 мл и проводили минерализацию и экстрагирование как указано в методике [28]. Полученные гексановые экстракты спектрофотометрировали в кюветах с толщиной светопропускающего слоя 10 мм при длине волны 328 нм. Одним из мешающих факторов при работе с биоматериалом была опалесценция. Для ее предотвращения увеличивали время центрифугирования.

Таблица 2.2.

Значения оптических плотностей гексановых экстрактов из отделов головного мозга белых крыс

БП – большие полушария

ПМ – промежуточный мозг

СР – средний мозг

МЗ – мозжечок

ПД – продолговатый мозг

СП – спинной мозг

Содержание ретинола ацетата в ЦНС рассчитывали по формуле:

[моль/л], ε=52480, l=1см.

[мкг/мл], М=328,5г/моль

[мкг/г]

         Таблица 2.3.

Содержание ретинола ацетата в отделах головного

мозга белых крыс

ВЫВОДЫ

1. Проработана литература  по вопросу значения, применения и определения жирорастворимых витаминов, в частности каротиноидов и витамина А. Наиболее проста в исполнении, доступна и чувствительна методика спектрофотометрического определения жирорастворимых витаминов.

2. Отработана методика спектрофотометрического определения ретинола ацетата, подобраны оптимальные условия омыления липидной фракции, мешающих определению витаминов и каротиноидов, подобраны условия экстрагирования ретинола ацетата. Сняты спектры полученных гексановых экстрактов с целью выяснения оптимальной длины волны.

3. Диапазоны концентрации ретинола ацетата, при которых соблюдается закон Бугера-Ламберта-Бэра от 0,9 до 4,5 мг  в пробе или 0,675 до 3,4 мкмоль/см3. Построен и рассчитан градуировочный график.

4. Проведено определение ретинол ацетата в тканях мозга интактных и опытных белых крыс. Результаты исследования свидетельствуют о снижении ретинола ацетата в тканях мозга под воздействием сероводородсодержащего газа и повышении его при введении витамина Е.

Библиографический список

1.Румянцев,Е.В. Химические основы жизни / Е.В.Румянцев, Е.В.Антина, Ю.В.Чистяков. – М.: Химия, Колос, 2007. – 560с.

2. Филлипович, Ю Б. Основы биохимии / Ю.Б.Филлипович. – М.: Изд-во «Агар», 1998. – 286с.

3. Справочник биохимика. Перевод с англ. / Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. – М.: Мир, 1991. – 114, 196, 422С.

4.Комов, В.П. Биохимия / В.П.Комов, В.Н.Шведова. – М.: Дрофа, 2002. – 638с.

5. Тырков, А.Г. Биоорганическая химия / А.Г.Тырков. - Астрахань.: Издательский дом «Астраханский университет», 2008.-236с.

6.Строев, Е.А. Биологическая химия / Е.А.Строев. – М.: Высшая школа, 1986. - 479с.

7. Никифорова, Н.В. Жирорастворимые витамины Е и А в опухолевой ткани и в крови больных почечноклеточным раком / Н.В.Никифорова, А.М.Чумаков, В.И.Кирпатовский, В.А.Комаров. – Урол.нефрол. – 1996. - №6. – 23-27с.

8.Березовский, В.М. Химия витаминов / В.М.Березовский. – 2-е изд. – М.: Пищевая промышленность, 1973. – 634с.

9.Спиричев, В. Б. Биологическая роль жирорастворимых витаминов / В.Б. Спиричев, И.Я. Конь. – Итоги науки и техники. – 1989. Т.37

10.Меньщикова, Е.Б. Окислительный стресс. Пероксиданты и антиоксиданты / Е.Б.Меньщикова, В.З.Ланин, Н.К.Зенков, И.А.Бондарь, Н.Ф.Круговых, В.А.Труфакин. – М.: Фирма «Слово», 2006. – 556с.

11. Pi Mascio P., Devasagagam T.P.A., Raiser., Siesh. Carotenoids, tocopherols, and thids as biological singlet molecular oxygen quenchers // Biochem. Soc. Trans. 1990. – Vol. 18.- P. 1054 -1056.

12. Palozza P., Galviello G., Bartoli G.M. Prooxidant activity of beta-carotene under 100% oxygen pressure in rat liver microsomes // Free Radic. Biol. Med. - 1995.- Vol.19.- P.887-892.

14.Юдаев, Н.А. Биохимия гормонов и гормональной регуляции / Н.А.Юдаев. - М.: «Наука», 1976, 379с.

15.Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А.Овчинников. – М.: Просвещение,   1987. – 815с.

16.Труфанов, А.Н. Биохимия и физиология витаминов и антивитаминов / А.Н.Труфанов. - М.: 1956г.

17. Шилов, П.И. Основы клинической витаминологии / П.И.Шилов, Т.Н.Яковлев. - Л.: 1964г.

18. Машковский М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский. – М.: ООО «Изд-во Новая волна» : издатель С.Б. Дилов, 2002. – 608с.

19. Ефремов, В.В. Важнейшие авитаминозы человека / В.В.Ефремов. - М.: 1939г.

20. Кудряшов, Б.А. Биологические основы учения о витаминах / Б.А.Кудряшов. - М.: 1948г.

21. Колобилова, А.И. Витамины / А.И.Колобилова. - Л.: 1976г.

22. Rosati C., Aquilani R., Dharmapuri S. et al. Metabolic engineering of beta-carotine and lycopene content in tomato fruit // Plant J. - 2000.- Vol.24.- P.412-419.

23. Pan W.H.,  Wang S.M. Et al. Vitamin F, vitamin E or beta-carotene status and hepatitis B-related hepatocellular carcinoma // Ann. Epidemol.- 1993/- Vol.3.-217-224 P.

24  Rousseau E.J., Davison F.J., Dunn B. Protection by  β-carotene and related compounds against oxygen-mediated cytotoxicity and genotoxicity – Implicationds for carcinogenesis and anticarcinogenesis // Free Radic. Biol. Med.- 1992. Vol.13. - P.407-433.

25. Rise-Evans C., Saimar A. Dietary antioxidants and nutrition // Reactive Oxygen Species in Biological Systems.- N.Y.: Kluwer Acad./Plenum Publ., 1999.- P.367-394.

26. Shewmaker C.K., Sheehy J.A., Daley M. et al. Seed – specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects // Plant J. 1999.- Vol.20. - P.401-412.

27. Ye X., Al-Babili S., Kloti A. et al. Engineering the provitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rise endosperm // Science.- 2000.- Vol. 287.- P.303-305.

28. Tailor, S. L. Sensitive fluorometric method for tissue tocopherol analysis [Text] / S. L. Tailor, M. P. Lambden, A. L. Tappel // Lipids. – 1976. – 11, № 7. – P. 530-538.