Бактериофаги
Предварительный просмотр:
Подписи к слайдам:
СТРОЕНИЕ БАКТЕРИОФАГОВ . Покоящаяся, внеклеточная, форма – вирион. Внутриклеточная форма – вегетативная . Вирион Головка белковый футляр (капсид) + нуклеиновая кислота Отросток имеет белковую природу, отличается по длине и строению
Морфологические типы фагов. I – нитевидные фаги II – фаги без отростка III - фаги с аналогом отростка IV – фаги с коротким отростком V – фаги с длинным несокращающимся отростком VI– фаги с длинным сокращающимся отростком
Наиболее сложно устроены фаги с сокращающимся чехлом отростка, например, Т- четные фаги (Т4) E. coli
Адсорбция фагов на бактериальной клетке
Взаимодействие фага с клеткой вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию , при которой происходит репродукция фагов и лизис бактериальной клетки умеренные фаги характерна интегративная инфекция , но могут вызывать и продуктивную инфекцию
Этапы продуктивной инфекции: 1я стадия . Адсорбция фага на чувствительной клетке. Происходит при наличии комплементарных рецепторов в клеточной стенке бактерий или на концах нитей фагового отростка. 2я стадия . Проникновение ДНК фага в бактериальную клетку. С помощью лизоцима осуществляется гидролиз участка клеточной стенки, чехол отростка сокращается и внутренний стержень прокалывает оболочку клетки. ДНК по каналу стержня проникает внутрь. 3я стадия . Внутриклеточное развитие фага. ДНК бактериофага направляет клеточные системы на биосинтез компонентов, необходимых для репродукции фагов. Сначала идет синтез «ранних белков» – ферментов, осуществляющих репликацию ДНК, а затем «поздних белков» – белков головки, отростка и т.д.
4я стадия . Морфогенез фага. Созревание фага - разобщенный процесс. Отдельно формируются головки фага: вокруг ДНК строится капсид. Независимо образуется отросток: формируется базальная пластинка, к ней прикрепляется внутренний стержень и одевается чехлом. Отдельно синтезируются нити отростка. Затем составные части фага объединяются, образуя вирионы. 5я стадия . Лизис бактериальной клетки и выход фага. Фаговый лизоцим гидролизует клеточную стенку и осуществляет лизис клетки. Бактериофаги выходят в окружающую среду.
Этапы продуктивной инфекции .
Интегративная инфекция (лизогения) ДНК фага включается в кольцевую хромосому бактериальной клетки. Во время деления клетки профаг (интегрированная ДНК фага) реплицируется в составе клеточного генома и переходит в следующие поколения бактерий. Бактериальная культура, инфицированная умеренным фагом, сохраняет жизнеспособность и становится лизогенной . . Фаговая конверсия : процесс изменения свойств бактерии, под действием дополнительного набора генов, внесенных профагом в клетку, с приобретением ею токсигенных свойств (например, появление способности к образованию экзотоксина у возбудителей ботулизма, дифтерии, скарлатины).
Лизогенная инфекция .
ИНДИКАЦИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА . В основе - принцип совместного посева исследуемого материала и чувствительной к искомому фагу культуры бактерий – тест-культуры. Метод обогащения с «подсевом». 1) Исследуемый материал суспензируют и фильтруют.Фильтрат и гомологичную тест-культуру вносят в пробирку с МПБ. Инкубируют. 2) Содержимое пробирки освобождают от бактерий (центрифугирование, фильтрование). 3) Фильтрат засевают с тест-культурой на чашки с МПА. Инкубируют. На МПА на фоне роста бактериальной культуры появляются округлые пятна – негативные колонии фага .
Негативные колонии фага 4) Материал из пятна переносят в пробирку с МПБ, добавляют тест культуру, инкубируют. Фаги, размножившись в бактериях, вызывают их лизис и в пробирке получают фаголизат, содержащий множество фагов. 5) Фаголизат полностью освобождают от бактерий.
Применение бактериофагов. 1. Для диагностики инфекционных заболеваний. а ) для определения видовой принадлежности выделенной культуры бактерий. б ) для фаготипирования – внутривидовой дифференциации чистой культуры бактерий. в ) с целью индикации возбудителя непосредственно в материале от больного с помощью РНФ (применяют редко).
Фаготипирование Основа метода : с помощью типовых фагов дифференцируют культуры одного вида на основании их различной чувствительности к набору таких фагов, то есть выявляют фаготип , что позволяет выявить источник заболевания и пути его распространения . Фаготипирование S. typhi. Используют набор типовых Vi- фагов (А, B , C , D , E) , каждый из которых лизирует культуры определенных фаговаров. Для типирования нужен фаг Vi -1, который лизирует все брюшнотифозные культуры, содержащие Vi - антиген, т.к. только такие культуры пригодны для постановки опыта.
Фаготипирование S. typhi. Постановка опыта: 1) Бульонную культуру засевают в виде капель на поверхность МПА. 2) На высохшие капли культуры наносят типовые Vi- фаги,а также фаг Vi- 1. Инкубируют. 3) Проводят учет результата опыта: культура должна полностью лизироваться фагом Vi- 1 и определенными типовыми фагами, что и позволяет определить ее фаговар (с помощью таблицы).
2. Для профилактики и лечения инфекционных заболеваний. Для лечения инфекционных болезней широко применяют антибиотики, но их неправильное использование вызывает осложнения. В качестве альтернативной терапии используют бактериофаги . Препараты бактериофага составлены из вирулентных бактериофагов широкого спектра действия, активных против антибиотикорезистентных бактерий. Их выпускают жидкими и лиофильно высушенными, в виде таблеток, кремов, мазей ,свечей. Перед применением необходимо определить фагочувствительность возбудителя инфекции.
Наиболее употребляемые препараты бактериофагов . Коли- протейный (смесь фаголизатов P . vulgaris и P.mirabilis) Стафилококковый бактериофаг Бактериофаг псевдомонас аеругиноза Сальмонеллезный бактериофаг Бактериофаг поливалентный (смесь фаголизатов стафилококков, стрептококков, E.coli , P . vulgaris и P.mirabilis)
ТИТРОВАНИЕ БАКТЕРИОФАГА ПО МЕТОДУ ГРАЦИА 1,0 мл фага смешивают в пробирке с 0,5 мл бактериальной культуры и добавляют в эту же пробирку расплавленный МПА. Все содержимое выливают в чашку с МПА. Дают застыть верхнему тонкому слою и ставят в термостат. При встрече фага с бактерией, происходит лизис последней и образуется негативная колония фага. Такие негативные колонии затем подсчитывают для определения титра. Титром фага называют количество фаговых частиц в 1 мл препарата фага.
ФАГОТИПИРОВАНИЕ БАКТЕРИЙ ПО МЕТОДУ ФИШЕРА Испытуемую суточную бульонную культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага.