Статьи

УДК 631.811.98 + 546.48

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУНА НА

НАКОПЛЕНИЕ КАДМИЯ У ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

О.И. Яхин1, А.А. Лубянов1,2, И.А. Яхин1, Б.Н. Постригань1,

А.В. Чемерис1, В.А. Вахитов1, Р.А. Батраев1

1Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии и генетики УНЦ РАН, 450054 Уфа, пр. Октября, 71, Россия, e-mail: yakhin@anrb.ru.

2Уфимский филиал ГОУ ВПО Оренбургский государственный университет, 450054 Уфа, пр. Октября, 67, Россия

Изучено влияние регулятора роста растений стифуна на накопление кадмия в растениях пшеницы и риса. При применении стифуна выявлено уменьшение аккумуляции кадмия в растениях пшеницы и отмечена тенденция уменьшения ингибирующего действия высокой концентрации ацетата кадмия (378 мкМ) на рост растений. При действии стифуна уменьшалась индуцированная кадмием транскрипционная активность гена фитохелатинсинтазы риса PCS1, что было сопряжено с меньшей аккумуляцией кадмия. В полевых условиях стифун уменьшал накопление кадмия в зерне и соломе пшеницы.

ВВЕДЕНИЕ

        Распространение тяжелых металлов (ТМ) в окружающей среде происходит вследствие как естественных природных процессов, так и антропогенной деятельности. Негативные эффекты ТМ на растения обусловлены их фитотоксическим действием [1, 2], их накопление в продукции растениеводства представляет опасность для здоровья человека. Одним из опаснейших ксенобиотиков среди тяжелых металлов является кадмий. При его аккумуляции в организме человека может происходить нарушение функции лёгких, почек, нервной и генеративной систем, повреждение костной ткани; обсуждается возможность его канцерогенного действия [3]. Длительный период полувыведения кадмия из организма человека может обусловливать риск хронического отравления. Одним из источников поступления кадмия в организм человека являются культивируемые растения. В связи с этим задача уменьшения накопления кадмия в хозяйственно-полезной части культурных растений и повышения их устойчивости к его токсическому действию является актуальной.

        Известно, что для уменьшения негативного влияния ТМ на рост сельскохозяйственных культур и снижения их аккумуляции в культурных растениях используют различные методы и приемы, в частности, известкование почв, внесение различных хелатирующих соединений и др. В последние годы активно исследуется возможность применения регуляторов роста растений (РРР) с целью регуляции устойчивости сельскохозяйственных культур к тяжелым металлам и снижения их аккумуляции. В этом аспекте большой интерес для изучения представляют препараты на основе природного сырья. Одним из таких препаратов является регулятор роста растений стифун [4], представляющий собой комплекс биологически активных веществ (аминокислот, фитогормонов, полисахаридов) растительного происхождения [5]. Ранее было установлено, что стифун влияет как на общий метаболизм растений, так и на синтез соединений, участвующих в формировании защитных реакций растений [6]. Активация роста растений при его действии обусловлена усилением интенсивности деления и растяжения клеток. Механизм рострегулирующего действия стифуна связан с изменениями в балансе фитогормонов АБК, ИУК, цитокининов.

        Цель настоящей работы – оценка физиологической активности регулятора роста стифуна в условиях токсического действия ионов кадмия на зерновые культуры. Исследования включали анализ влияния стифуна на морфометрические параметры пшеницы и аккумуляцию ими кадмия, а также - в модельных опытах на растениях риса - сопряженность экспрессии гена фитохелатинсинтазы (PCS1) и накопления кадмия.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований и постановка экспериментов

        Объекты исследований - растения пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Ирменка и риса (Oryza sativa L.) сорта Рапан. Препаративную форму стифуна (водорастворимый порошок) получали по ранее описанной методике [5].

        Семена растений перед посевом стерилизовали в 70%-ном этаноле и проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, увлаженной дистиллированной водой, в термостате при 250С. 2-х суточные растения выдерживали в течение 1 ч в водном растворе регулятора роста (доза - 33 мг/л). Затем их помещали на раствор ацетата кадмия (378 мкМ) на 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и инкубировали при 250С. Контроль – дистиллированная вода. В опытах определяли линейные размеры, сырую и сухую массу растений. Индекс устойчивости растений (I) к присутствию кадмия в среде оценивали по отношению массы растения в варианте с присутствием металла к массе растения в контроле [1].

        В полевых экспериментах стифун применяли путем предпосевной обработки семян из расчета 400 мг/т семян при норме рабочего раствора 12 л/т.

Определение содержания кадмия в растениях

Для количественного определения кадмия использовали атомно-абсорбционный спектрофотометр с пламенным атомизатором ААS-30 (Carl Zeiss, ГДР). В данной методике на всех этапах работы использовали дистиллированную воду. В фарфоровые тигли добавляли воду и 0.5 мл азотной кислоты. Кипятили 1 час, выливали, споласкивали водой и прокаливали в муфельной печи при t = 2000С. В колбы на 50 мл добавляли воду и 1 мл азотной кислоты. Кипятили 1 час и споласкивали водой. Затем прокаливали в сушильном шкафу. Взвешивали фарфоровые тигли после прокаливания. Пробы растений помещали в фарфоровые тигли, вновь взвешивали, помещали в холодную муфельную печь. Сначала озоление проводили при температуре t = 2000С в течение 2-х часов (до обугливания проб), затем − при температуре t = 525 - 5500С в течение 5-6 часов. После охлаждения тиглей зольный остаток смачивали 0.5 мл воды, добавляли 10 мл разбавленной (1:1) азотной кислоты и кипятили 30 минут. Затем из тиглей зольный остаток фильтровали через фильтр «белая лента» в мерные колбы емкостью 50 мл. Несколько раз ополаскивали водой тигли и фильтры, и общий объем доводили до 50 мл.

        Одновременно с обработкой пробы проводили «холостой» опыт, заменяя анализируемую пробу водой. К 100 мл воды добавляли 6 мл азотной кислоты, перемешивали, кипятили в течение 20 минут. Далее фильтровали в колбочки на 100 мл и доводили до метки водой. Приготовленную пробу распыляли в пламени горелки и снимали показания концентрации на табло прибора. После пяти последовательных измерений анализируемых проб, распыляли один из градуировочных растворов для контроля стабильности работы прибора. Если измеренная величина выходила за пределы градуировочного графика, то пробы разбавляли.

Массовую концентрацию металла Х (мг/дм3) рассчитывали по формуле:

,

где: С – концентрация исследуемой пробы, полученная прямым отсчетом с табло прибора, мг/ дм3;

Схол – результат анализа «холостой пробы», мг/ дм3 ;

V – объем исследуемого раствора, мл;

Δm – масса навески растения, г.4

Массу навески растения (Δm) находили из соотношения:

Δm = m1-m2,

m1 – масса фарфорового тигля с навеской, г;

m2 – масса фарфорового тигля, г.

Определение транскрипционной активности гена фитохелатинсинтазы (PCS1) риса

        При изучении гена фитохелатинсинтазы риса PCS1 - NC_008396 (NCBI) применяли метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием FRET-эффекта на платформе «УФА» [7]. Из растений РНК выделяли тризоловым методом (Invitrogen, США). Навеску растений растирали в агатовой ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния, не допуская оттаивания растительного материала, переносили в 2 мл полипропиленовую пробирку (Eppendorf, Германия), содержащую 1 мл реактива TRIzol (Invitrogen, США) и перемешивали при энергичном встряхивании, после чего пробирки выдерживали при температуре 40С в течении 10-15 минут. Пробирки помещали в рефрижераторную центрифугу (Eppendorf, Германия) на 10 минут при 13000 об./мин. К надосадочной жидкости добавляли хлороформ, встряхивали, и снова центрифугировали. Верхний водно-солевой слой, содержащий РНК, отбирали пипеткой и повторно депротеинизировали хлороформом; эту операцию повторяли 3-4 раза. Отбирали водно-солевую фазу и после осаждения изопропанолом осадок РНК промывали 70%-ным этанолом. При необходимости удаление примеси ДНК осуществляли обработкой ДНК-азой.

Образцы были выровнены по РНК по спектру поглощения при 260 нм.

        Для детекции ПЦР-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству нарабатываемого ПЦР-продукта. ПЦР в реальном времени на платформе "УФА" проводили в 20 мкл реакционной смеси содержащей: буфер (40 мМ Трис-HCl pH 8.0, 2.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl); 20 фмоль ДНК; 1 ед. акт. ST-полимеразы; по 0.5 пмоль прямого и обратного праймеров, меченных разными флуорохромами (донором и акцептором), по 0.25 мМ каждого из дНТФ и соответствующее количество деионизованной воды в ДНК амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ (Bio-Rad, США).

        Для проведения ПЦР праймеры были подобраны «на стыке» между первым и вторым экзоном кодирующей части гена фитохелатинсинтазы, таким образом, исключая возможный вклад геномной ДНК. Синтез кДНК проходил в одну реакцию, поскольку использовалась ST-полимераза, обладающая также ревертазной активностью. Условия реакции подбирались в соответствии с имеющимися праймерами: денатурация при 940С, 30 сек, отжиг при 58-600С, 25 сек, и элонгация при 720С, 35 сек в 36 циклах. Результаты получали в виде сигмообразных кривых амплификации и кривых плавления. Температура отжига праймеров, а также температура плавления целевых продуктов варьировала в разных экспериментах в зависимости от GC-состава используемых олигонуклеотидов.

        Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторах и четырех-пяти - аналитических. В иллюстрациях и таблицах представлены средние арифметические значения и стандартные отклонения. Статистическую значимость между вариантами в экспериментах оценивали с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

        Ацетат кадмия в исследуемой концентрации оказывал ингибирующее действие на рост растений пшеницы (рис. 1), которое было выражено сильнее на корнях по сравнению с побегами. При обработке растений стифуном наблюдалась тенденция предотвращения негативного действия кадмия на их линейные размеры, сырую и сухую массу (рис. 1 А, Б, В).

        При действии кадмия наблюдалось уменьшение оводненности растений на протяжении всего периода экспозиции на 29%, 30%, 33%, 30%, соответственно (табл. 1). Эти результаты не противоречат литературным данным, свидетельствующим о том, что поглощение воды корнями может уменьшаться при действии кадмия [8]. При обработке растений стифуном выявлялась тенденция предотвращения уменьшения оводненности.

        При оценке устойчивости пшеницы на ранних этапах развития к присутствию ионов кадмия в среде В.С. Барсуковой (1997) показано, что в зависимости от сорта устойчивость растений может варьировать от очень низкой (I=0.21) до супервысокой (I=1.2) [1]. Анализ полученных нами морфометрических данных свидетельствует, что индекс устойчивости растений пшеницы при воздействии кадмия в течение 24ч, 48ч, 72ч, 96ч составлял 0.73, 0.82, 0.83, 0.80, а в варианте с применением стифуна перед экспозицией на растворе ацетата кадмия - 0.90, 0.90, 0.89, 0.86, соответственно. Как следует из этих результатов, стифун повышал показатель индекса устойчивости, что может свидетельствовать о его протекторном действии в условиях стрессового действия ионов кадмия.

        Важным фактором, определяющим устойчивость растений к тяжелым металлам, является ограничение их поступления в надземную часть [1, 9]. Как показали результаты оценки динамики поглощения Cd2+, растения пшеницы накапливали значительно больше кадмия в корнях по сравнению с побегами (табл. 2). Следует отметить, что интенсивное накопление металла в корнях происходило в течение первых 24-х часов экспозиции на растворе ацетата кадмия, достигая максимума через 48 ч. В то же время в побегах процесс аккумуляции кадмия был линейным, наибольшая концентрация металла выявлялась в конце срока экспозиции (через 96 ч). По данным исследователей в корнях твердой и мягкой пшеницы накопление кадмия при использовании сульфата кадмия в концентрациях 170 и 215 нМ было линейным в течение 75 мин, через 4 ч его скорость уменьшалась, но кадмий продолжал аккумулироваться в течение всего периода инкубации (24 ч) [10]. При действии стифуна в растениях пшеницы отмечалось меньшее накопление кадмия как в побегах, так и в корнях: через 24 ч – на 31% и 11%, через 48 ч – на 40% и 26%, 72 ч – на 32% и 8%, 96 ч - 15% и 9%, соответственно (табл. 2).

        Следует отметить, что при уменьшении концентрации кадмия как в корнях, так и в побегах при действии стифуна (табл. 2), его распределение между побегами и корнями при применении регулятора роста характеризовалось очень слабо выраженной тенденцией повышения доли кадмия в корнях по сравнению с действием только Cd2+ (рис. 2). Ранее на рисе было выявлено, что при инкубации растений в течение 10 суток на среде, содержащей кадмий и абсцизовую (АБК) или гибберелловую кислоты (ГК3), более выраженное уменьшение уровня кадмия в побегах и корнях при действии фитогормонов сопровождалось, как показал анализ процентного распределения кадмия между побегом и корнями, - значимым повышением доли кадмия в корнях [11].

        Известно, что поглощение кадмия растениями может зависеть от pH среды [12]. Как видно из рис. 3, значения pH содержащей кадмий среды, на которой выращивались растения, были выше по сравнению с контролем. Эти результаты в определенной степени согласуются с данными литературы. Так, показатель pH растворов корневых экссудатов пшеницы на двух различных средах культивирования возрастал от pH ≈ 5.8 и 5.9 (в контроле в зависимости от среды) до значений pH ≈ 6.4 и 6.5, 6.3 и 6.4, 6.0 и 6.3, 5.85 и 6.2, когда в среде присутствовал кадмий (9 сут) в концентрациях 0.5, 5, 15, 50 мг/л, соответственно [13]. Обнаруженные исследователями различия в уровнях pH сопровождались качественными и количественными изменениями ряда аминокислот и вторичных метаболитов [13]. По нашим данным обработка растений стифуном перед помещением их на раствор ацетата кадмия практически не изменяла pH среды в динамике по сравнению с pH раствора, содержащего кадмий, на котором росли растения, необработанные регулятором роста (рис. 3). Таким образом, в данном опыте изменение поглощения кадмия при применении стифуна не сопровождалась изменением pH среды, на которой выращивались растения.

        Известно, что кадмий очень мобилен и может накапливаться не только в корнях и листьях, но и в зерне [1]. При поступлении Cd2+ в зерно пшеницы кадмий проходит длительный путь до его попадания в зерно [14]. В накоплении в зерне кадмия может участвовать флоэмный транспорт [10], тем не менее, растения стараются не допустить его поступления в важные органы, – так значительное количество кадмия задерживалось в цветоножке [14]. Физиологический смысл этого явления, по-видимому, заключается в задержании токсичных элементов с целью предотвращения их поступления в репродуктивные органы растений. Как показали наши данные, в полевых условиях при действии стифуна происходило уменьшение концентрации кадмия в соломе и зерне пшеницы на 59% и 28%, соответственно. Следует также отметить, что наряду со снижением содержания кадмия при применении стифуна было установлено уменьшение уровня и другого тяжелого металла – свинца, на 30% и 33%, соответственно (табл. 3).

        Как показывают литературные данные, влияние регуляторов роста на устойчивость растений к токсическому действию тяжелых металлов и аккумуляцию последних в органах и тканях является неоднозначным. Показано, что регуляторы роста могут как уменьшать, так и увеличивать содержание ТМ в органах и тканях растений, а также, не влияя на их концентрацию, оказывать выраженное действие на фитотоксичность ТМ [15-18]. Брассиностероиды, в том числе 24-эпибрассинолид, блокировали поглощение и аккумуляцию ТМ у растений ячменя, озимой и яровой пшеницы [19, 20]. Снижение фитотоксичности ТМ при применении регуляторов роста амбиола и эль-1 не сопровождалось достоверным уменьшением концентрации кадмия и свинца в биомассе ячменя [15]. При применении эпина, циркона в условиях действия высоких концентраций кадмия (5 и 50 мг/кг почвы) на яровой пшенице сорта Лада было показано, что они оказывали стабилизирующее действие на рост и развитие ассимиляционной поверхности и оптимизировали условия формирования, продуктивность и структуру урожая [21]. При оценке влияния циркона на урожайность и показатели роста растений яровой пшеницы, а также фитотоксичность кадмия (10 мг/кг) и его накопление в зерне и соломе в условиях вегетационного опыта было показано, что предпосевная обработка семян регулятором роста практически не оказывала влияния на переход металла в растения, тогда как обработка по вегетации вызывала значимое уменьшение коэффициента накопления до 1.8 раза [22]. Его применение было эффективнее при невысоком уровне загрязнения почвы кадмием (10 мг/кг почвы).

        При применении удобрений и предпосевной обработке семян ростстимулирующими препаратами (гуми, гуми+Si, гиббереллин, пектин) проявлялась тенденция к снижению накопления тяжелых металлов в зерне озимой пшеницы [23]. В экспериментах с мягкой пшеницей при выращивании растений в почве, содержащей кадмий и свинец в концентрациях 1.5 и 150 мг/кг, соответственно, и использовании раствора, содержащего гуминовые кислоты (140, 280 и 560 мг/кг), было показано, что применение гуминовых кислот на низкоплодородных почвах может улучшать питание растений, мобилизуя из почвы питательные вещества и обеспечивая растения источниками углерода, но с другой стороны - могли увеличиваться и доступность, и транспорт тяжелых металлов в континууме почва–растение и впоследствии - увеличить риск для окружающей среды [17].

        Было показано, что униконазол - регулятор роста растений триазольной группы индуцирует устойчивость к Cd2+ растений пшеницы [24, 25]. Применение паклобутразола (замачивание семян в течение 18 ч), являющегося ингибитором биосинтеза гиббереллина и ретардантом, приводило к уменьшению накопления кадмия в листьях растений риса при экспозиции 12 суточных растений на растворе CdCl2 [25]. При обработке растений риса в течение 16 ч салициловой кислотой при выращивании растений на среде, содержащей Cd2+, происходило снижение его накопления [18].

        В модельном эксперименте с растениями риса была проведена оценка влияния стифуна на накопление кадмия (рис. 4). При обработке растений стифуном с последующей экспозицией на растворе ацетата кадмия в течение 24 ч содержание металла в побегах было меньше на 54% по сравнению с вариантом, где растения выращивали на растворе кадмия без применения регулятора роста.

        Растения имеют развитые системы защиты, обеспечивающие эффективную детоксикацию ионов Cd2+ путем образования комплексов и секвестрации их в вакуоли [26]. Важную роль в этих процессах играют фитохелатины – пептиды, синтез которых осуществляется фитохелатинсинтазой (ФХС), кодируемой соответствующими генами. Гены фитохелатинсинтаз опосредуют детоксикацию металлов у эукариот [27]. В их регуляции могут принимать участие различные сигнальные системы и фитогормоны. Так, когда обработка АБК предшествовала воздействию Cd2+, уровни ФХС и транскрипта StPCS1 увеличивались, и было установлено негативное взаимодействие между АБК и кадмием [28]. Учитывая приведенные выше данные об уменьшении накопления кадмия в растениях при действии стифуна, представлялось важным оценить его участие в регуляции экспрессии гена фитохелатинсинтазы. Ранее в рамках работ по исследованию молекулярных механизмов функционирования генов фитохелатинсинтаз на основе анализа нуклеотидной последовательности генома риса были подобраны праймеры для амплификации как предполагаемой промоторной области гена фитохелатинсинтазы риса (PCS1), так и его кодирующей части протяженностью около 900 пн и 2400 пн, соответственно, а также условия проведения ПЦР-РВ, основанной на переносе флуоресцентной резонансной энергии (FRET) [7, 29]. В настоящей работе в качестве модельной системы использовали ген фитохелатинсинтазы риса (PCS1).

        Как видно, в отсутствие действия кадмия применение стифуна практически не вызывало изменения экспрессии гена фитохелатинсинтазы через 1 ч после обработки (рис. 5). Аналогичные результаты были получены через 4 и 6 ч.

        При действии ацетата кадмия в течение 1.5 часов наблюдалась индукция экспрессии гена фитохелатинсинтазы риса PCS1 в побегах и корнях 8-суточных растений риса сорта Рапан (рис. 6). При применении стифуна выявлялось уменьшение индуцированной Cd2+ транскрипционной активности гена PCS1. Следует отметить, что через 24 ч экспозиции уровень индуцированной Cd2+ экспрессии был выше, чем у необработанных кадмием растений.

ВЫВОДЫ

1. Обработка растений пшеницы регулятором роста стифуном перед их экспозицией на растворе ацетата кадмия способствовала уменьшению накопления металла как в корнях, так и в побегах.

2. При применении стифуна выявлена тенденция уменьшения ингибирующего действия высокой концентрации ацетата кадмия (378 мкМ) на линейные размеры, показатели сырой и сухой массы растений пшеницы на начальных этапах роста.

3. Предпосевная обработка семян стифуном в полевых условиях способствовала уменьшению накопления кадмия и свинца в зерне и соломе пшеницы.

4. В модельном эксперименте показано, что обработка растений риса стифуном не вызывала изменения активности транскрипции гена фитохелатинсинтазы PCS1, в то время как действие кадмия проявлялось в ее увеличении. При обработке растений стифуном перед их экспозицией на растворе ацетата кадмия снижалась индуцированная кадмием транскрипционная активность этого гена, что было сопряжено с меньшей аккумуляцией металла.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Барсукова В.С. Физиолого-генетические аспекты устойчивости растений к тяжелым металлам. Новосибирск, ГПНТБ СО РАН. 1997. 63 с.
2. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environmental and Experimental Botany. 1999. V. 41. P. 105–130.
3. Jarup L. Hazards of heavy metal contamination // British Medical Bulletin. 2003. V. 68. P. 167–182.
4. Яхин О.И. Исследование физиологической активности препарата стифун на растениях яровой пшеницы и картофеля. Автореф. дисс... канд. биол. наук. Уфа. 1999. – 24 с.
5. Яхин И.А., Вахитов В.А., Исаев Р.Ф., Яхин О.И. Способ повышения урожайности сельскохозяйственных растений. Патент РФ N. 2076603. 1997. Бюл. № 10.
6. Яхин О.И., Яхин И.А., Вахитов В.А., Лубянов А.А. К механизму действия природного биорегулятора стифуна // Доклады Академии наук. 2006. Том 411. № 1. С. 118-121.
7. Чемерис А.В., Никоноров Ю.М., Чемерис Д.А., Гарафутдинов Р.Р., Романенкова М.Л., Матниязов Р.Т., Гималов Ф.Р., Малеев Г.В., Вахитов В.А. Детекция в реальном времени специфических фрагментов ДНК или РНК с помощью основанных на FRET-эффекте полимеразной, лигазной и гибридизационной цепных реакций // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии. 2005. Т. 1. № 2. С. 5-14.
8. Salt D.E., Prince R.C., Pickering I.J., Raskin I. Mechanisms of cadmium mobility and accumulation in Indian mustard // Plant Physiol. 1995. 109. P. 1427–1433.
9. Hsu Y.T., Kao C.H. Role of abscisic acid in cadmium tolerance of rice (Oryza sativa L.) seedlings // Plant, Cell & Environment 2003. V. 26. Iss. 6. P. 867 – 874.
10. Hart J.J., Welch R.M., Norwell W.A., Sullivan L.A., Kochian L.V. Characterization of cadmium binding, uptake, and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 1413 – 1420.
11. Rubio M.I., Escrig I., Martinez-Cortina C., Lopez-Benet F.G., Sanz A. Cadmium and nickel accumulation in rice plants. Effects on mineral nutrition and possible interactions of abscisic and gibberellic acids // Plant Growth Regul. 1994. 14. P. 151 – 157.
12. Iretskaya S.N., Chien S.H. Comparison of Cadmium Uptake by Five Different Food Grain Crops Grown on Three Soils of Varying pH // Commun. Soil Sci. Plant Anal. 1999. V. 30. № 3-4. P. 441-448.
13. Zhang L., Yan X. Effect of cadmium on root exudes of wheat (Triticum aestivum L.) under different cultures media // Bull. Environ. Contam. Toxicol. 2003. 71. P. 698 – 705.
14. Herren T., Feller U. Transport of cadmium via xylem and phloem in maturing wheat shoots: comparison with the translocation of zinc, strontium and rubidium // Annals Bot. 1997. V. 80. P. 623 – 628.
15. Ульяненко Л.Н., Круглов С.В., Филипас А.С., Арышева С.П. Влияние регуляторов роста на развитие растений ячменя и накопление в них тяжелых металлов и цезия-137 // Агрохимия. 2004 а. № 12. С. 15-22.
16. Ульяненко Л.Н., Круглов С.В., Филипас А.С., Арышева С.П., Маркина А.В., Влияние гумата натрия на развитие растений салата и накопление тяжелых металлов в урожае // Агрохимия. 2004 б. № 4. С. 58-64.
17. Chen B., Zhu Y.-G. Humic Acids Increase the Phytoavailability of Cd and Pb to Wheat Plants Cultivated in Freshly Spiked, Contaminated Soil // J Soils Sediments. 2006. V. 6. № 4. P. 236 – 242.
18. Choudhury S., Panda S.K. Role of Salicylic acid in regulating cadmium induced oxidative stress in Oryza sativa L. roots // Bulg. J. Plant Physiol. 2004. V. 30. № 3-4. P. 95-110.
19. Khripach V., Zhabinskii V., De Groot A. Twenty years of brassinosteroids: steroidal plant hormones warrant better crops for the XXI century // 2000 Annals Bot. V. 86. P. 441-447.
20. Прусакова Л.Д., Чижова С.И. Применение брассиностероидов в экстремальных для растений условиях // Агрохимия. 2005. № 7. С. 87 – 94.
21. Серегина И.И. Возможность применения регуляторов роста для снижения негативного действия кадмия на рост, развитие и продуктивность яровой пшеницы // Агрохимия. 2004. № 1. С. 71 – 74.
22. Ульяненко Л.Н., Арышева С.П., Филипас А.С., Круглов С.В., Малеванная Н.Н., Пименов Е.П. Продуктивность, морфометрические признаки растений яровой пшеницы и накопление кадмия в урожае под влиянием регулятора роста Циркон // Сельскохозяйственная биология. 2005. № 5. С. 75 – 80.
23. Музурова О.Г. Экологические перспективы использования природных росторегуляторов для предотвращения загрязнения агрофитоценозов озимой пшеницы Автореф. дисс... канд. биол. наук. Ульяновск. 2006. – 24 с.
24. Singh V.P. Uniconazole (S-3307) induced cadmium tolerance in wheat // J Plant Growth Regul. 1993. V. 12. P. 1–3.
25. Hsu Y.T., Kao C.H. Abscisic acid accumulation and cadmium tolerance in rice seedlings // Physiologia Plantarum. 2005. V. 124. P. 71 – 80.
26. Heiss S., Wachter A., Bogs J., Cobbett C. Phytochelatin synthase (PCS) protein is Brassica juncea leaves after prolonged Cd // J. Exp. Bot. 2003. V. 54. № 389. P. 1833-1839.
27. Clemens S., Palmgren M.G., Krämer U. A long way ahead: understanding and engineering plant metal accumulation // Trends in Plant Sci. 2002. V.7 № 7 P. 309 – 315.
28. Chadzinikolau T., Stroinski A., Gizewska K., Nuc P. Influence of cadmium ñ abscisic acid interaction on phytochelatin synthase activity in Solanum tuberosum // Biological Lett. 2005. V. 42. № 2. P. 178.
29. Постригань Б.Н. Клонирование промотора и кодирующей области гена фитохелатинсинтазы риса Oryza sativa // Ломоносов-2006. материалы XIII межд. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. Сборник докладов. 2006. – М.: МГУ. Т. 4. С. 21-22.

THE EFFECT OF PLANT GROWTH REGULATOR STIFUN ON

ACCUMULATION OF CADMIUM IN GRAIN CROPS

O.I. Yakhin1, А.А. Lubyanov1,2, I.А. Yakhin1, B.N. Postrigan’1, A.V. Chemeris1, V.А. Vakhitov1, R.A. Batraev1

1Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Center, Russian Academy of Sciences, 450054 Ufa, pr. Oktyabrya 71, Russia; e-mail: yakhin@anrb.ru.

2Ufa Branch of Orenburg State University, 450054 Ufa, pr. Oktyabrya 67, Russia

The effect of plant growth regulator stifun on accumulation of cadmium in wheat and rice plants was studied. Stifun decreased Cd accumulation in wheat shoot and root. There was the tendency of Cd inhibitory effect reducing on plants growth under high concentration of cadmium acetate solution (378 mkM). Stifun decreased cadmium induced transcriptional activity of PCS1 rice gene, this could be attended with reducing of Cd accumulation. In field conditions stifun reduced Cd accumulation in the wheat straw and grain.

Рис. 1А. Влияние стифуна на линейные размеры растений пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия

Рис. 1Б. Влияние стифуна на биомассу побегов пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия

Рис. 1В. Влияние стифуна на биомассу корней пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия

Таблица 1. Влияние стифуна на оводненность растений пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия

Таблица 2. Влияние стифуна на концентрацию кадмия (мкг/г сухой массы) в растениях пшеницы в динамике при экспозиции на растворе ацетата кадмия

Примечание: различия по сравнению с действием только кадмия значимы при

* – p < 0.05; ** - p < 0.01

Рис. 2. Распределение кадмия между корнями и побегами у растений пшеницы при действии стифуна

Рис. 3. Влияние ацетата кадмия и стифуна на pH растворов, в которых инкубировались растения пшеницы.

Таблица 3. Влияние стифуна на концентрацию тяжелых металлов в растениях пшеницы в полевых условиях

Примечание: различия по сравнению с контролем значимы при * - p<0.05

Рис. 4. Влияние стифуна на накопление кадмия в побегах риса при экспозиции 24 ч на растворе ацетата кадмия.

Примечание: * - статистически значимые различия между вариантами (р<0.05)

Рис. 5. Влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса сорта Рапан. А - Кривые амплификации: 1- контроль (растения без обработки); 2 – стифун (экспозиция 1 ч); 3 – отрицательный контроль (не содержит матрицу); 4 -ДНК риса. Б – кривые плавления для данных вариантов, соответственно.

А

                                                                                                           № цикла

Рис. 6. А. Влияние стифуна на экспрессию гена фитохелатинсинтазы риса при действии ацетата кадмия. Кривые амплификации:  1, 2. - стифун (корни, побеги); 3. ацетат кадмия+стифун (корни); 4. контроль (побеги); 5. контроль (корни); 6. ацетат кадмия (побеги); 7. ацетат кадмия (корни); 8. ацетат кадмия+стифун (побеги); 9. отрицательный контроль (не содержит матрицу).

Б

                                                                                        Температура, 0С

Рис. 6 (продолжение). Б – кривые плавления. В - электрофорез после выделения РНК риса. Дорожки: 1- контроль (растения без обработки); 2 - 378 мкМ ацетат кадмия, 3 – 37.8 мкМ ацетат кадмия, 4 – 378 мкМ ацетат кадмия+стифун. Г - Электрофорез образцов продуктов ПЦР. Дорожки: 1- контроль (растения без обработки); 2 - 378 мкМ ацетат кадмия; 3 - 378 мкМ ацетат кадмия+стифун; 4 – 37.8 мкМ ацетат кадмия; 5 - отрицательный контроль (не содержит матрицу).

Авторы статьи

Олег Ильдусович Яхин, тел./факс (347)2356088,

e-mail: yakhin@anrb.ru

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

Александр Александрович Лубянов, тел./факс (347)2375555,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 67, Уфимский филиал ГОУ ВПО Оренбургский государственный университет,

Ильдус Аглямович Яхин, тел./факс (347)2356088,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

Богдан Нилович Постригань, тел./факс (347)2356088,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

Алексей Викторович Чемерис, тел./факс (347)2356088,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

Венер Абсатарович Вахитов, тел./факс (347)2356088,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН,

Роберт Артурович Батраев, тел./факс (347)2356088,

450054, г. Уфа, проспект Октября, д. 71, Институт биохимии и генетики УНЦ РАН

УДК 581.1 + 631.811.98 : [632.112 + 632.111.6 + 546.33’131 + 546.48 + 661.162.2]

Лубянов А.А., Яхин О.И., Калимуллина З.Ф., Батраев Р.А., Яппаров И.Ф., Гайнетдинова Е.М.

Уфимский филиал ГОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН

ГОУ ВПО «Башкирский государственный педагогический университет

им. М. Акмуллы»

E-mail: yakhin@anrb.ru.

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КУЛЬТУРНЫХ РАСТЕНИЙ ПРИ

ПРИМЕНЕНИИ РЕГУЛЯТОРА РОСТА СТИФУНА В УСЛОВИЯХ

АБИОТИЧЕСКИХ СТРЕССОВЫХ ФАКТОРОВ

Исследованы антистрессовые свойства регулятора роста стифуна при действии водного дефицита, хлоридного засоления, гипотермии, тяжелых металлов, гербицидов на ранних этапах роста сельскохозяйственных растений. Выявлено, что стифун обладал способностью уменьшать негативное действие исследованных стрессовых факторов. Использование регулятора роста особенно эффективно при водном дефиците.

Ключевые слова: регуляторы роста растений, водный дефицит, хлоридное засоление, гипотермия, тяжелые металлы, гербициды, пшеница, капуста

        Культурные растения на протяжении всего вегетационного периода подвергаются воздействию широкого спектра абиотических (водный дефицит, хлоридное засоление, гипотермия, тяжелые металлы, пестициды и др.) стрессовых факторов, оказывающих лимитирующее действие на их рост, продуктивность и качество урожая. Одним из приемов уменьшения негативных эффектов неблагоприятных воздействий является применение регуляторов роста растений. Следует отметить, что растения испытывают как одновременное, так и чередующееся действие нескольких стрессовых факторов. В связи с этим поиск полифункциональных антистрессовых препаратов является актуальной задачей. Цель работы - оценка антистрессовой активности регулятора роста стифуна при действии абиотических стрессов.

        Объекты исследований: растения яровой пшеницы Triticum aestivum L. сортов Жница, Ирменка, Омская-35, капусты посевной Brassica oleraceae L. сорта Амагер 611. Семена стерилизовали 70%-этанолом, проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге увлажненной водопроводной водой в темноте при 240С в течение 2-3 суток. Исследуемый в работе регулятор роста стифун [1], представляющий собой комплекс биологически активных соединений растительного происхождения, был получен в группе биологически активных соединений (ИБГ УНЦ РАН). При моделировании стрессовых условий использовали воздействие дефицита влаги (влагообеспеченность - 40%), низкой положительной температуры (+50C), хлоридного засоления (раствор NaCl - 0.5%, 1%, 1.5%), ацетата кадмия (100 мг/л), гербицидов: логран (д.в. триасульфурон) - 4 мкг/мл, аврорекс (кэ д.в. 2,4-Д + карфентразон) - 2 мкл/мл, диален супер (кэ д.в. 2,4-Д + дикамбы кислоты) - 2 мкл/мл, топик (кэ, д.в. клодинафоп-пропаргила + антидот клоквинтосет-мексила) - 20 мкл/мл. Гербицидами опрыскивали 3, 4 суточные проростки пульверизатором с мелкодисперсным распылением раствора. При засолении и кадмиевом стрессе 2-суточные проростки помещали на растворы солей. При гипотермии проростки в стаканах с песком помещали в холодильную камеру. Для моделирования дефицита влаги почву высушивали при 1500С до полного сухого состояния и добавляли воду до необходимой концентрации. Семена пшеницы, обработанные стифуном, проращивали в почве с разным уровнем влагообеспеченности в течение 9 суток в термостате при 240С. Стифун (0.003 % раствор) применяли путем обработки семян, внесения в среду выращивания растений, а также опрыскивания растений. Контроль - дистиллированная вода. Различия в интенсивности роста оценивали по изменению сырой, сухой массы, а также линейных размеров проростков.

        Как показали результаты исследований снижение влаги в почве до 40% заметно ингибировало рост корневой системы и надземной части растений пшеницы (табл. 1). Применение стифуна предотвращало негативное влияние дефицита влаги, обеспечивая высокие показатели роста растений. Необходимо отметить, что при использовании стифуна формировалась более мощная корневая система.

Таблица 1 Влияние стифуна на морфометрические параметры проростков пшеницы сорта Жница в условиях дефицита влаги (% от контроля)

        В следующем эксперименте мы оценивали антистрессовые свойства стифуна в условиях хлоридного засоления (табл. 2).

Таблица 2. Влияние стифуна на всхожесть семян пшеницы при действии хлоридного засоления (% от контроля)

Было установлено, что NaCI снижал всхожесть семян пшеницы, причем его ингибирующее действие усиливалось с возрастанием концентрации. Обработка семян стифуном способствовала увеличению всхожести во всех вариантах.

        Известно, что тяжелые металлы способны негативно влиять на рост и метаболизм растений, вызывать нарушения хромосомного аппарата клеток, накапливаясь в них. Существенное ингибирование ростовых процессов у растений пшеницы, обусловленное токсическим действием кадмия, было следствием сильно выраженной дисрегуляции метаболических процессов [2, с. 717]. В настоящей работе при моделировании кадмиевого стресса экспозиция растений пшеницы на растворе ацетата кадмия приводила к ингибированию морфометрических параметров растений двух исследованных сортов пшеницы (табл. 3). В результате обработки проростков стифуном выявлено уменьшение ростингибирующего действия кадмия на линейные размеры, массу корней и побегов. При оценке потенциала устойчивости растений пшеницы на ранних этапах развития к присутствию ионов кадмия в среде было установлено, что индекс устойчивости растений может варьировать от очень низкого (0.21) до супервысокого (1.2) [3, с. 37]. При действии кадмия показатель индекса устойчивости, оцениваемый по отношению массы растения в варианте – кадмий или кадмий+стифун к массе растения в контроле [3], составил соответственно 0.75 и 0.81 (Жница), 0.73 и 0.83 (Ирменка). В условиях кадмиевого стресса существенно снижалась оводненность растений: на 45% (Жница), 41% (Ирменка). При этом стифун предотвращал уменьшение оводненности на 22% и 20%, соответственно.

Таблица 3. Влияние cтифуна на линейные размеры и массу растений пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия в течение 48 ч (% от контроля)*

*Примечание: показатели в контроле приняты за 100 %

При низкой положительной температуре стифун проявлял стимулирующую активность на растениях капусты по показателю сырой массы (табл. 4).

        Известно, что гербициды могут оказывать токсическое действие не только на сорные растения, но и на культурные. В литературе имеются данные об использовании регуляторов роста растений (гумат натрия, эпин, хлорхолинхлорид) в качестве протекторных агентов при негативном действии гербицидов [4, с. 64].

Таблица 4. Влияние стифуна на прирост биомассы растений капусты в условиях гипотермии

Нами была проведена оценка физиологической активности стифуна при действии различных гербицидов на растениях пшеницы. Как видно из таблицы 5, через 48 часов после обработки лограном наблюдалось ингибирование роста проростков. При совместном применении лограна и стифуна происходило уменьшение негативного действия гербицида.

Таблица 5. Влияние cтифуна на линейные размеры и массу растений пшеницы сорта Омская 35 при применении гербицидов (% от контроля)*

*Примечание: показатели в контроле приняты за 100 %

Через 72 часа после применения гербицидов аврорекс, диален супер, топик уменьшались все исследованные морфометрические параметры растений. При опрыскивании растений этими гербицидами и стифуном выявлено выраженное предотвращение токсического эффекта гербицида, что могло быть обусловлено защитным либо стимулирующим действием регулятора роста. Следует отметить, что наблюдалось негативное действие гербицидов как на надземную часть растений, так и корневую систему. Необходимо обратить внимание, что протекторное действие стифуна лучше видно при сравнении сухой массы растений, что может свидетельствовать о его положительном влиянии на биосинтетические процессы в растениях в условиях стресса. По результатам наших опытов можно сделать вывод о негативном влиянии на рост растений исследованных концентраций гербицидов и антидотном эффекте стифуна.

        Ранее было показано, что стифун обладает ростстимулирующей активностью и увеличивает урожайность пшеницы [5, c. 8]. Регуляция роста и устойчивости культурных растений на начальных этапах онтогенеза является важным фактором оптимизации формирования в дальнейшем их продуктивности. В связи с этим полученные нами новые данные, свидетельствующие об антистрессовых свойствах регулятора роста стифуна в условиях различных стрессовых воздействий абиотической природы, могут иметь большое значение для практического растениеводства.

        Различные абиотические стрессы вызывают сверхпродукцию активных форм кислорода в растениях, которые являются высоко реактивными и токсичными, что приводит в конечном итоге к окислительному стрессу [6, с. 924]. В целом вовлечение активных форм кислорода в различные метаболические процессы в растительных клетках может иметь общее значение при различных видах стресса. Учитывая выявленную в данной работе полифункциональность стифуна в условиях целого ряда абиотических стрессовых факторов - водного дефицита, хлоридного засоления, гипотермии, тяжелых металлов, гербицидов, в дальнейших экспериментах при исследованиях механизмов его действия будет проведено изучение влияния данного регулятора роста на антиоксидантную систему растений.

Список использованной литературы:

1. Яхин И.А., Вахитов В.А., Исаев Р.Ф., Яхин О.И., Ибрагимов Р.И. Изучение биологической активности препарата «Стифун» // Итоги научных исследований биологического факультета Башкирского госуниверситета за 1995 г. – Уфа, Башкирский госуниверситет. – 1996. – С. 13 – 14.
2. Яхин О.И., Яхин И.А., Лубянов А.А., Вахитов В.А. Влияние кадмия на содержание фитогормонов и свободных аминокислот, его цитогенетическое действие и аккумуляция у культурных растений // Доклады Российской Академии наук. - 2009. - Т.426. - № 5. - С. 714 – 717.
3. Барсукова В.С. Физиолого-генетические аспекты устойчивости растений к тяжелым металлам. Аналитический обзор. Новосибирск. - 1997. Изд-во ГПНТБ СО РАН. – 63 с.
4. Ремпе Е.Х., Воронина Л.П., Батурина Л.К. Регуляторы роста растений как фактор снижения негативного действия пестицидов // Агрохимия. - 1999. - №3. - С.64-69.
5. Яхин И.А., Яхин О.И., Исаев Р.Ф. Влияние препарата стифун на рост и продуктивность яровой пшеницы // Доклады Российской Академии сельскохозяйственных наук. – 1999. - № 6. - С. 8-10.
6. Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants // Plant Physiology and Biochemistry. – 2010. – V. 48. – P. 909 – 930.

Lubyanov А.А., Yakhin O.I., Kalimullina Z.F., Batraev R.A., Yapparov I.F., Gaynetdinova E.M.

Ufa Branch of Orenburg State University

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Center, RAS

Bashkir State Pedagogical University of M. Akmulla

E-mail: yakhin@anrb.ru

HIGHER PLANTS RESPONSES UNDER APPLICATION OF GROWTH

REGULATOR STIFUN IN CONDITIONS OF ABIOTIC STRESS FACTORS

Antistress activity of growth regulator stifun were investigated under water deficiency, salinity, hypothermia, heavy metals, herbicides at early stages of agricultural plants development. It is revealed that stifun reduced negative action of the investigated stress factors. The use of growth regulator was effective at water stress especially.

Keywords: plant growth regulator, water deficiency, salinity, hypothermia, heavy metals, herbicides, wheat, cabbage

Bibliography:

1. Yakhin I.A., Vakhitov V.A., Isaev R.F., Yakhin O.I., Ibragimov R.I. Investigataion of biological activity of preparation "Stifun"//Results of scientific studies of biological faculty of Bashkir state university for 1995 – Ufa, Bashkir state university. – 1996. – P. 13 – 14.
2. Yakhin O.I., Yakhin I.A., Lubyanov A.A., Vakhitov V.A. Effect of cadmium on the content of phytohormones and free amino acids, its cytogenetic effect, and accumulation in cultivated plants // Doklady Biological Sciences. - Vol. 426. - № 1. - 274-277.
3. Barsukova, V.S., Fiziologo-geneticheskie aspekty ustoichivosti rastenii k tyazhelym metallam (Physiological and Genetic Aspects of Plant Stability to Heavy Metals), Novosibirsk: Gos. Publ. Nauchno-Tekhn. Bibl. Sib. Otd. Ross. Akad. Nauk. - 1997.– 63 p.
4. Rempe, E. Kh, Voronina, L. P., Baturina, L. K. Plant Growth Regulators as a Factor for Reducing the Negative Effect of Pesticides. Agrokhimiya. P. 64-69.
5.  Yakhin I.A., Yakhin O.I., Isaev R.F. Influence of Stifun on the growth and development of spring wheat plants // Russian agricultural sciences. 1999. - № 12.
6. Gill S.S., Tuteja N. Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in crop plants // Plant Physiology and Biochemistry. – 2010. – V. 48. – P. 909 – 930.

УДК 581.19 + [631.811.98 + 546.48] : 577.112.3

Яхин О.И., Лубянов А.А., Калимуллина З.Ф., Батраев Р.А.

Учреждение Российской Академии наук Институт биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН

Уфимский филиал ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

E-mail: yakhin@anrb.ru

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА СТРЕСС-ИНДУЦИРУЕМОЕ

НАКОПЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ

В РАСТЕНИЯХ ПШЕНИЦЫ

Проведена оценка участия регуляторов роста в формировании устойчивости растений в условиях стресса. Исследовано влияние «стифуна-6М» на содержание свободных аминокислот (АК) в норме и при токсическом действии ионов кадмия. Обсуждается роль возрастания пролина при действии регуляторов роста как фактора активации неспецифической устойчивости растений к стрессу.

Ключевые слова: регуляторы роста растений, свободные аминокислоты, стресс, кадмий, устойчивость, пшеница яровая

        Свободные аминокислоты играют важную роль в растениях, являясь структурными единицами вновь синтезируемых белков, участвуют в биосинтезе вторичных соединений и регулируют многие биохимические процессы. Они могут участвовать в формировании механизмов устойчивости растений к стрессам различной природы: водному дефициту, засолению, температурному стрессу, участвуют в процессах детоксикации ксенобиотиков. Изучение влияния физиологически активных веществ на метаболизм АК является важной составляющей исследования механизмов их регуляторного и антистрессового действия. Цель работы - оценка влияния регулятора роста «стифун-6М» на содержание отдельных свободных аминокислот в нормальных условиях и в условиях токсического действия ионов кадмия.

Объект исследований - яровая пшеница (Triticum aestivum L.) сорта Жница. В работе использовали улучшенную препаративную форму стифуна-6М (водорастворимый порошок), полученную по ранее описанной методике [1] с модификациями. Семена растений стерилизовали в 70%-ном этаноле. Растения выращивали в стеклянных стаканах с раствором регулятора роста (3.3 мг/л) и/или ацетата кадмия (50 мкM), на воде (контроль) в течение 14 суток на плотиках из пробкового материала с отверстиями (диаметр 4 мм) для размещения проклюнувшихся семян, предварительно проращенных в термостате на воде в течение 24 часов при температуре 240С. Количественный анализ свободных АК проводили на аминокислотном анализаторе «Hitachi 835» (Япония).

        Как показали результаты исследований стифун-6М обладал ростстимулирующим действием: сухая масса корней и надземной части 1 растения возрастала с 3.8 мг до 5.1 мг и с 13.3 мг до 15.4 мг, соответственно. Уровень большинства АК возрастал в корнях и надземной части (рис. 1). Для понимания механизма действия регулятора роста необходимо обсудить выявленные изменения содержания АК в связи с путями их биосинтеза и функциями в растениях. К биосинтетическому семейству аспарагиновой кислоты, образующейся из оксалоацетата цикла Кребса, относятся треонин, лизин, метионин, изолейцин [2, с. 179]. Глутаминовая кислота, синтезируемая из α-кетоглутарата, участвует в биосинтезе таких аминокислот как пролин, аргинин, гистидин. Пируват является предшественником аланина, из которого, могут синтезироваться лейцин и валин. Два других биосинтетических семейства включают цистеин, серин, глицин, и, триптофан, тирозин, фенилаланин. При действии стифуна-6М уровень глутаминовой кислоты уменьшался в надземной части (рис. 1), что могло быть связано с ее участием в биосинтезе других аминокислот. Так, отмечалось увеличение уровня пролина, который обладает осморегуляторным и стресс-протекторным действием, его защитный эффект может быть опосредован антиоксидантными свойствами [3, с.321]. Также возрастал уровень аргинина, из которого по орнитиновому пути может идти синтез пролина.

Рис. 1 Влияние стифуна-6М на содержание свободных аминокислот в корнях и надземной части растений пшеницы

Увеличивались уровни лизина и изолейцина, а содержание аспарагиновой кислоты несколько возрастало в надземной части растений. При действии регулятора роста уровень треонина был выше в корнях и ниже в надземной части, а метионина – значительно превышал контроль в надземной части и уменьшался в корнях. Метионин является одной из ключевых аминокислот, выполняя центральную роль в инициации трансляции мРНК. В растениях через его метаболит – S-аденозилметионин осуществляется контроль уровня таких значимых метаболитов как этилен, полиамины и биотин [4, с. 917]. S-аденозилметионин является первичным донором метильной группы, регулирующей процессы клеточного деления, синтеза клеточной стенки, хлорофилла и др. Он участвует в реакциях синтеза различных ароматических соединений. Возрастание уровня метионина в целом растении при действии стифуна-6М, по-видимому, свидетельствует об активации метаболических процессов. При действии регулятора роста возрастало содержание другой серусодержащей аминокислоты – цистеина. Cерин и глицин характеризовались близкими профилями изменений. Цистеин и глицин наряду с глутаминовой кислотой являются компонентами глутатиона, играющего важную роль в метаболизме и обладающего антиоксидантными свойствами. Для группы аминокислот шикиматного пути – тирозина и фенилаланина при действии регулятора роста наблюдалось их значительное возрастание. Они являются предшественниками многих фенольных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами и участвующих в процессе лигнификации растительных клеток. Рассматривая группу, в которую входят аланин, лейцин и валин, следует отметить значительное увеличение уровня лейцина в надземной части при действии стифуна-6М. Существенно возрастал уровень аланина в корнях и надземной части. При действии стифуна-6М увеличивалось суммарное содержание АК как в надземной части, так и в корнях, что приводило к возрастанию их пула в растении на 33%. Его увеличение может быть результатом снижения либо активации биосинтеза белка, нарушений в транспорте АК и (или) в процессах, где они принимают участие [5, с. 445]. Так как стифун-6М стимулировал ростовые процессы, то можно предполагать активацию синтеза аминокислот.

        Повышение уровня свободных АК, активация их синтеза как результат применения физиологически активных веществ обсуждаются в литературе в связи с устойчивостью растений к стрессовым факторам [6., с. 697]. Выявленное нами изменение уровней ряда аминокислот при применении стифуна-6М позволило предположить его протекторные свойства при стрессовых воздействиях. В настоящей работе в качестве модели стрессового действия мы рассмотрели токсическое влияние ионов тяжелых металлов (ТМ). При использовании в наших опытах ацетата кадмия в ростингибирующей концентрации сухая масса и длина 1 растения при действии стифуна-6М на фоне кадмия (Cd) возрастала с 7.6 мг (Cd) до 8.3 мг и с 6.7 см (Cd) до 7.8 см. При действии ацетата кадмия отмечалось возрастание уровня отдельных и суммарного содержания АК (рис. 2). Регулятор роста поддерживал более высокий по сравнению с кадмием уровень аспарагиновой кислоты, серина, пролина, цистеина, валина, фенилаланина, гистидина, при этом возрастал пул АК. Отмечалась стабилизация уровней аланина и аргинина. Известно, что аспарагин, глутаминовая кислота, цистеин, метионин, гистидин и глицин обладают способностью связывать ТМ [7, с. 309; 8, с. 719; 9, с. 109]. Метионин является предшественником никотинамина, участвующего в детоксикации ТМ и формировании устойчивости к стрессу, вызываемому металлами [8, с. 721]. Цистеин является важным метаболитом в антиоксидантной защите и секвестрации ТМ, так как он необходим для синтеза метионина и глутатиона/фитохелатинов.

Рис. 2 Влияние стифуна-6М на содержание свободных аминокислот в растениях пшеницы в условиях токсического действия ионов кадмия

В данном эксперименте при действии кадмия значительно увеличивалось содержание пролина. Металл-индуцированное накопление пролина рассматривается как прямое следствие поглощения металла, с другой стороны его накопление может являться следствием вызываемого кадмием водного дефицита [8, с. 716; 10, с. 119]. Пролин может принимать прямое участие в детоксикации ТМ за счет связывания, или опосредованное – в качестве осмопротектора, возрастание его содержания рассматривается в качестве механизма, отвечающего за повышение устойчивости растений к ТМ [8, с. 716; 11, с. 453]. Выявленное увеличение содержания пролина при действии кадмия могло быть связано с участием в биосинтезе хелатирующих пептидов [11, с. 453].

        Оценивая влияние регуляторов роста на метаболизм аминокислот, исследователи обсуждали выявленную ими активацию пролина в корнях гречихи как неспецифическую реакцию в связи с повышением устойчивости растений к стрессам [12, с. 97]. Применение салициловой кислоты в условиях Cu-стресса, приводившего к возрастанию содержания пролина в корнях, стеблях, листьях подсолнечника, уменьшало его накопление в стебле, но индуцировало - в корнях, что могло являться одним из защитных механизмов ее действия [13, с. 191]. Повышение эпибрассинолидом засухоустойчивости растений могло быть обусловлено увеличением уровня свободных АК, участвующих в осморегуляции [6, с. 700].

        Таким образом, установленное увеличение содержания отдельных аминокислот при действии стифуна-6М позволяет предполагать возможность активации регулятором роста неспецифических защитных реакций растений как фактора предадаптации к токсическому действию высокой концентрации кадмия при длительной экспозиции.

Список использованной литературы:

1. Яхин И.А., Вахитов В.А., Исаев Р.Ф., Яхин О.И. Способ повышения урожайности сельскохозяйственных растений. Патент РФ № 2076603. – 1997. – Бюл. № 10.
2.  Nikiforova1 V. J., Bielecka M., Gakiere B. et al. Effect of sulfur availability on the integrity of amino acid biosynthesis in plants // Amino Acids. – 2006. – V. 30. – P. 173–183.
3. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиол. Растений. – 1999. – Т. 46. № 2. – С. 321–336.
4. Amir R. Current understanding of the factors regulating methionine content in vegetative tissues of higher plants // Amino Acids. – 2010. – V. 39. – P. 917–931.
5. Shtemenko N.I. Biochemical mechanisms that are involved in the process of adaptation of plants to environmental contaminants // Sixth Intern. Simp. Exhibit. Environm. Contamin. in Central Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States. – 2003. – Prague. – P. 444-447.
6. Пустовойтова Т.Н., Жданова Н.Е., Жолкевич В.Н. Повышение засухоустойчивости растений под воздействием эпибрассинолида // ДАН. – 2001. – Т. 376. №. 5. – С. 697-700.
7. Peer W.A., Baxter I.R., Richards E.L. et al. Phytoremediation and hyperaccumulator plants. In Molecular Biology of Metal Homeostasis and Detoxification // Topics in Current Genetics. – 2005. – V. 14. –  Springer, Berlin. P. 299-340.
8. Sharma S.S., Dietz K.-J. The significance of amino acids and amino acid-derived molecules in plant responses and adaptation to heavy metal stress // J. Exp. Bot. – 2006. – V. 57. – №. 4. – P. 711-726.
9. Wierzbicka M.H., Przedpelska E., Ruzik R. et al. Comparison of the toxicity and distribution of cadmium and lead in plant cells // Protoplasma. – 2007. – V. 231. – P. 99–111.
10. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environ. Exp. Bot. – 1999. – V. 41. – P. 105–130.
11. Wu F.-B., Chen F., Wei K., Zhang G.-P. Effect of cadmium on free amino acid, glutathione and ascorbic acid concentrations in two barley genotypes (Hordeum vulgare L.) differing in cadmium tolerance // Chemosphere. – 2004. – V. 57. – P. 447- 454.
12. Дёмина Е.А., Тищенко Л.Я., Шестак О.П. и др. Влияние синтетических циклопентановых β,β’-трикетонов на метаболизм аминокислот в корнях проростков гречихи (Fagopyrum esculentum Moench.) // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т. 45. – № 1. – С. 97 – 103.
13.  El-Tayeb M.A., El-Enany A.E., Ahmed N.L. Salicylic acid-induced adaptive response to copper stress in sunflower (Helianthus annuus L.) // Plant Growth Regul. – 2006. – V. 50. – P. 191–199.

Yakhin O.I., Lubyanov А.А., Kalimullina Z.F., Batraev R.A.

Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Science Center, RAS

Ufa Branch of Orenburg State University

E-mail: yakhin@anrb.ru

EFFECT OF PLANT GROWTH REGULATORS ON STRESS-INDUCED ACCUMULATION OF FREE AMINO ACIDS IN WHEAT PLANTS

The participation of growth regulators in formation of plant tolerance in stress conditions was considered. The effect of stifun-6M on levels of free amino acids in norm and under toxic action of cadmium ions was estimated. The role of proline accumulation under action of growth regulators is discussed as factor of plant nonspecific tolerance activation to stress.

Keywords: plant growth regulators, free amino acids, stress, cadmium, tolerance, wheat

Bibliography:

1. Yakhin I.A., Vakhitov V.A., Isaev R.F., Yakhin O.I. Method of agriculture crop productivity increase. The patent of Russian Federation № 2076603. – 1997. – The bulletin № 10.
2.  Nikiforova1 V. J., Bielecka M., Gakiere B. et al. Effect of sulfur availability on the integrity of amino acid biosynthesis in plants // Amino Acids. – 2006. – V. 30. – P. 173–183.
3. Kuznetsov V.V., Shevyakova N.I. Proline under stress: biological role, metabolism, and regulation // Russian Journal of Plant Physiology. – 1999. – V. 46. № 2. – P. 274-287.
4. Amir R. Current understanding of the factors regulating methionine content in vegetative tissues of higher plants // Amino Acids. – 2010. – V. 39. – P. 917–931.
5. Shtemenko N.I. Biochemical mechanisms that are involved in the process of adaptation of plants to environmental contaminants // Sixth Intern. Simp. Exhibit. Environm. Contamin. in Central Eastern Europe and the Commonwealth of Independent States. – 2003. – Prague. – P. 444-447.
6. Pustovoitova T. N., Zhdanova N. E., and Zholkevich V. N. Epibrassinolide Increases Plant Drought Resistance // Doklady Biochemistry and Biophysics. - Vol. 376. – 2001. P. 36–38.
7. Peer W.A., Baxter I.R., Richards E.L. et al. Phytoremediation and hyperaccumulator plants. In Molecular Biology of Metal Homeostasis and Detoxification // Topics in Current Genetics. – 2005. – V. 14. –  Springer, Berlin. P. 299-340.
8. Sharma S.S., Dietz K.-J. The significance of amino acids and amino acid-derived molecules in plant responses and adaptation to heavy metal stress // J. Exp. Bot. – 2006. – V. 57. – №. 4. – P. 711-726.
9. Wierzbicka M.H., Przedpelska E., Ruzik R. et al. Comparison of the toxicity and distribution of cadmium and lead in plant cells // Protoplasma. – 2007. – V. 231. – P. 99–111.
10. Sanita di Toppi L., Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants // Environ. Exp. Bot. – 1999. – V. 41. – P. 105–130.
11. Wu F.-B., Chen F., Wei K., Zhang G.-P. Effect of cadmium on free amino acid, glutathione and ascorbic acid concentrations in two barley genotypes (Hordeum vulgare L.) differing in cadmium tolerance // Chemosphere. – 2004. – V. 57. – P. 447- 454.
12. Demina E. A., Tishchenko L. Ya., Shestak O. P. et al. Effect of Synthetic Cyclopentane b,b'-Triketones on Amino Acid Metabolism in Roots of Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) Seedlings // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2009. – Vol. 45. – № 1. P. 87–92.
13.  El-Tayeb M.A., El-Enany A.E., Ahmed N.L. Salicylic acid-induced adaptive response to copper stress in sunflower (Helianthus annuus L.) // Plant Growth Regul. – 2006. – V. 50. – P. 191–199.

Сведения об авторах: _______________________________________________

«Статья публикуется впервые»  _______________________________ 25.12.2010 г.