научно - исследовательская работа учащихся по экологии

МУНИЦИПАЛЬНОЕ ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«СРЕДНЯЯ ОБРАЗОВАТЕЛЬНАЯ ШКОЛА №39 Г. БЕЛГОРОД»

ТЕМА РАБОТЫ:

«Использование  Daphnia magna в качестве биотеста для определения острой и хронической токсичности воды Белгородского водохранилища в районе плотины».

НОМИНАЦИЯ: ВОДНАЯ ЭКОЛОГИЯ И ГИДРОБИОЛОГИЯ

АВТОР:

Ковляшенко Дмитрий Николаевич, 8 «А» класс

РУКОВОДИТЕЛЬ:

Морозова Елена Александровна

2011 г.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Глава 1. Обзор источников информации о биотестировании природных вод

Глава 2. Методика проведения биотестирования воды из Белгородского водохранилища

Глава 3. Результаты исследования и их анализ

Выводы

Использованная литература и интернет – источники

Приложения

Введение.

В последние 5-10 лет особое внимание уделяется методам биологического мониторинга, которые основаны на использовании живых организмов, особенно чувствительных к конкретным химическим веществам. Использование методов биомониторинга не требует больших экономических затрат (дорогостоящей аппаратуры, больших лабораторий и т.д.), а также позволяет оценить качество среды в случаях, когда количественное содержание загрязнителя может быть определено каким-либо методом, но отсутствуют сведения о биологической активности загрязнителя.

Биомониторинг является составной частью экологического мониторинга и включает в себя следующие подсистемы: биотестирование, биоиндикацию и биоаккумуляцию.

Биотестирование и биоиндикация - это два схожих исследовательских приема, в которых о качестве среды, о факторах, воздействующих на эту среду, судят по выживаемости, продуктивности, поведению, а также по различным физико-биологическим параметрам живых организмов. Биотестирование подразумевает использование живых организмов, специально помещаемых в данную среду (тест-объекты), а биоиндикация - живых организмов, естественным образом обитающих в данной среде.

Например, в Голландии широко используют различные полезные для человека растения в качестве тест-объектов на больших площадях страны: гладиолусы и тюльпаны являются тест-объектами на накопление фторидов; итальянская ржаная трава - тест-объект на накопление ионов тяжелых металлов.

Биотестирование с помощью таких высокочувствительных к загрязнению разного рода (ионы тяжелых металлов, нефтепродукты, УФ-излучение и т.д.) тест-объектов, как дафнии (рачки - фильтраторы водоемов), пиявки, инфузории (простейшие), хлорелла (микроводоросль) и другие, находит в настоящее время широкое применение во многих странах.

 Биоаккумуляция - частный случай биотестирования или биоиндикации, в котором о качестве среды, о факторах, воздействующих на эту среду, судят по степени накопления вредных веществ в живых организмах.

В настоящее время общепризнана необходимость введения нового вида контроля качества вод - биотестирование на токсичность, - интегральный показатель, отражающий реальную картину токсического загрязнения водных объектов.

Оценка токсичности природныъх вод  с помощью биотестирования широко применяется за рубежом, но не нашла должного применения в системе государственного мониторинга поверхностных вод суши (ПВС) Росгидромета.

Цель работы: изучить острую и хроническую токсичность природной воды Белгородского водохранилища путем биотестирования с использованием в качестве тест – объекта  Daphnia magna.

Достижение поставленной цели предполагает решение следующих задач:

1. изучить методическую базу мониторинга природных объектов путем биотестирования;
2. изучить эколого – биологические особенности жизнедеятельности тест – объекта Daphnia magna  ;
3. освоить методику проведения биотестирования природных вод;
4. установить степень загрязнения воды Белгородского водохранилища.

Актуальность данной работы заключается в необходимости широкого внедрения данного метода мониторинга для оценки токсичности природных вод, так как метод биотестирования с использованием  Daphnia magna обладает рядом преимуществ над остальными биологическими методами мониторинга природных объектов:

- они экспрессны (определение острой токсичности возможно за 96 ч, хронической токсичности - за 28 -30 сут;;

- они компактны (могут использоваться в полевых условиях);

- возможно проведение анализов микрообъемов воды (от 2 - 5 мл, для дафний требуется 1 - 1,5 л воды для анализа одной пробы);

- возможно проведение непрерывных анализов (нет необходимости в постановке отдельных экспериментов по установлению острой и хронической токсичности воды);

- экономически целесообразны.

Практическая значимость. Материалы и результаты работы могут быть использованы на внеклассных занятиях по экологии, а также для широкого информирования местного населения о состоянии природных вод Белгородского водохранилища.

Обзор источников информации о  биотестировании природных вод

Под биотестированием (bioassay) обычно понимают процедуру установления токсичности среды с помощью тест-объектов, сигнализирующих об опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов.

Для биотестирования используются различные гидробионты - водоросли, микроорганизмы, беспозвоночные, рыбы. Наиболее популярные объекты - ювенальные формы (juvenile forms) планктонных ракообразных-фильтраторов Daphnia magna, Ceriodaphnia affinis.

Важное условие правильного проведения биотестирования - использование генетически однородных лабораторных культур, так как они проходят поверки чувствительности, содержатся в специальных, оговоренных стандартами лабораторных условиях, обеспечивающих необходимую сходимость и воспроизводимость результатов исследований, а также максимальную чувствительность в токсическим веществам. В ходе биостестирования исследуется тест – функция тест – объекта.

Тест-функция (test function) – это жизненная функция или критерий токсичности (toxicity criterion), используемые в биотестировании для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды.

Выделяют следующие тест-фукнкции, используемые в качестве показателей биотестирования для различных объектов:

- для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых - выживаемость (смертность) тест-организмов.

- для ракообразных, рыб, моллюсков - плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток.

-  для культур одноклеточных водорослей и инфузорий - гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры.

- для растений - энергия прорастания семян, длина первичного корня и др.

Длительность биотестирования зависит от задачи, поставленной исследователем. Она может быть нескольких видов:

А) Острые биотесты (acute tests), выполняемые на различных тест-объектах по показателям выживаемости, длятся от нескольких минут до 24-96 ч.

Б) Краткосрочные (short-term chronic tests) хронические тесты длятся в течение 7 суток и заканчиваются, как правило, после получения первого поколения тест-объектов.

В) Хронические тесты (chronic tests) на общую плодовитость ракообразных, охватывающие 3 поколения, длятся до рождения молоди в F3.

В ходе биотестирование исследуется токсический эффект вещества на организмы.

Токсический эффект (toxic effect) – это изменение любого показателя жизнедеятельности или функций организма под воздействием токсиканта. Зависит от особенностей яда, специфики метаболизма организма, факторов внешней среды (содержание кислорода, рН, температуры и др.).

Под токсичностью(toxicity)  среды понимается cвойство химических веществ проявлять поверждающее или летальное действие на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое действие, называется токсикантом, а процесс воздействия токсиканта на организм - токсикацией (на экосистему - токсификацией). По Н.С.Строганову, количественно токсичность вещества для отдельного организма определяется как величина, обратная медианной летальной концентрации: Т = 1/LC50.

Токсичность водной среды (toxicity of water environment) – это токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающая вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр. При возникновении токсичности водной среды вода из среды, поддерживающей жизнь, становится средой, губительной для жизни. Степень токсичности водной среды оценивается методами биотестирования, а также по превышению ПДК (предельно допустимых концентраций).

При биотестировании  используют определение острой и хронической токсичности, поэтому необходимо их различать.

Острая токсичность выражается в гибели отравленного организма за короткие промежуток времени - от нескольких секунд до 96 ч. Хроническая токсичность среды проявляется через некоторое время в виде нарушений жизненных функций организмов и возникновения патологических состояний (токсикозов). У водных организмов хроническая токсичность выражается в гонадотропном и эмбриотропном действии токсиканта, что приводит к нарушению плодовитости (продуктивности), эмбриогенеза и постэмбрионального развития, возникновению уродств (мутаций) в потомстве, сокращению продолжительности жизни, появлению "карликовых" форм

Гибель тест-объектов – это не единственный критерий токсичности. Существует достаточно много методов биотестирования, которые дают прекрасные результаты, но вытеснить выживаемость. а также плодовитость и качество потомства они не смогли. Показатель "выживаемость/смертность" , конечно, не самый чувствительный. Но с него обычно начинают оценку токсичности природных или морских вод. Более важным для водной экосистемы является критерий плодовитости и качества потомства. В биотестировании используется лабораторная культура партеногенетических  самок, которые каждые 8-14 день рождают молодь, которая отличается от взрослых самок только размерами. Это позволяет изучать влияние отдельных веществ в ряде поколений, что очень важно для прогнозирования последствий попадания в водную среду тех или иных токсикантов.

Методика проведения биотестирования воды.

        Методика основана на установлении различия между количеством погибших дафний в анализируемой пробе (опыт) и культивационной воде (контроль).

        Критерием острой летальной токсичности является гибель 50% дафний и более в опыте по сравнению с контролем за 96 ч биотестирования.

Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы

Применяются следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы:

- микрокомпрессор аквариумный АЭН ТУ 16-064-011;

- лупа складная ГОСТ 7954, ТУ 3-3-227;

- груши резиновые разные (пипеточные луковицы) ТУ 38-106-003;

- термолюминостат, поддерживающий температуру воды (20±2)°С, освещенность (500+100) лк;

- термометр по ГОСТ 112 с ценой деления шкалы 1°С; холодильник, поддерживающий температуру (4±2)°С;

- рН-метр ГОСТ 25.7416.0171 или аналоги;

- колбы мерные по ГОСТ 1770, вместимостью 0,5 и 1,0 дм3 по ГОСТ 1770, 2 класса точности;

- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;

- вату и марлю для изготовления ватно-марлевых пробок;

- пипетки мерные вместимостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ 29227, 2 класса точности;

- посуду стеклянную: вместимостью 2 дм3 для культивирования дафний; вместимостью от 100 до 150 см3 для биотестирования; вместимостью 1 дм3 для транспортирования и хранения проб воды;

- цилиндры мерные вместимостью 0,1; 0,5 и 1,0 дм3 по ГОСТ 1770, 2 класса точности;

- дрожжи хлебопекарные по ГОСТ 171;

- культура зеленых водорослей (для корма - родов Chlorella или Scenedesmus).

Условия выполнения биотестирования

Биотестирование проводят в помещении, где не хранят и не работают с летучими веществами, не используют обработку помещения инсектицидами.

        Объем пробы воды для определения острой летальной токсичности должен быть не менее 1 дм3.

        Температура анализируемой пробы при биотестировании должна быть (20±2)°С, концентрация кислорода в пробе в начале биотестирования - не менее 6 мг/дм3. Если его концентрация ниже 6 мг/дм3, пробу аэрируют микрокомпрессором. Воздух должен подаваться равномерно до достижения концентрации кислорода 6 мг/дм3. Во время биотестирования пробу не аэрируют.

        Битестирование проводят при рассеянном свете. Не допускается попадание прямых солнечных лучей на тест-объект. Длительность светового периода соответствует естественному. Рекомендуется использовать термолюминостат.

         Плотность посадки односуточных дафний в опыте и контроле должна составлять 10 экземпляров на 100 см3. Повторность трехкратная.

Описание тест – объекта

        В качестве тест-объекта используют лабораторную культуру дафний - Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) (Приложени1, фото 1).

Хотя для первичной оценки острой токсичности воды можно было использовать и природных представителей из Белгородского водохранилища. Однако необходимо помнить, что организмы, взятые в природных водоемах, генетически неоднородны, часто и обитают в загрязненных водоемах и адаптированы к различным загрязняющим веществам. Для корректного использования таких организмов в качестве тест-объектов для биотестирования следует, как минимум, провести их акклимацию в стандартных лабораторных условиях.

Оптимальным подходом можно считать более длительный и сложный, но оправданный путь - получения достаточного для экспериментов количества потомства во втором и последующих поколениях. У Дафны магна, например, потомство было получено от одной партеногенетической самки, которая дала начало новой лабораторной культуре.

Дафния магна одна из самых широко известных видов ветвистоусых рачков и самая крупная среди дафний, обитающих в наших водоемах. Она достигает длины 5-6 мм. Магна обычно живет в мелких водоемах.  Тело у нее заключено в полупрозрачную двустворчатую раковину, скрепленную на спинке и расходящуюся на брюшной стороне.

Раковину дафния периодически сбрасывает и заменяет новой. Голова дафнии спереди вытянута в остренький "клюв" или "хоботок" На голове находятся два глаза, которые у полностью развитых экземпляров сливаются в один сложный глаз. У многих видов рядом с ним находится еще один небольшой глаз. На голове имеются две пары антенн. Передние антенны - палочковидные, очень маленькие. Зато задние антенны непропорционально велики по сравнению с телом. Они ветвисты, причем каждая ветвь антенны снабжена длинными перистыми щетинками. Задние антенны служат основным органом передвижения ветвистоусых, одновременно взмахивая обеими задними антеннами, рачки отталкиваются ими и таким образом плывут короткими скачками. Регулируя частоту взмахов антен, дафнии могут не только "парить", но и подниматься в верхние слои воды или, наоборот, уходишь на глубину. Таким образом, они совершают вертикальные перемещения (миграции), связанные с поиском пищи, изменением температуры воды или времени суток. Грудной отдел ветвистоусых укорочен и состоит из 4 - 6 сегментов, каждый из которых снабжен парой ножек. У самок между спинной поверхностью тела и спинным краем раковины имеется обширная полость, выполняющая задачу выводковой камеры. В эту сумку откладываются яйца, где они и развиваются. Летом, в теплую погоду, в выводковой камере самки формируются неоплодотворенные яйца (по 50-100 штук у каждой особи), из которых выходят только самки, очень быстро покидающие тело матери. Поэтому, как правило, все пойманные летом дафнии оказываются самками. В течение всего лета самки размножаются партеногенетически. С наступлением холодов из некоторых яиц рождаются самцы, а у самок начинают образовываться яйца, которые могут развиваться лишь после оплодотворения самцом. Самцы у дафний редки, появляются обычно к осени и всегда значительно мельче самок. После оплодотворения ими самок образуются яйца (обычно не более двух), богатые желтком и совершенно непрозрачные. Оболочка с яйцами образует седлышко, или эфиппий. Эфиппии свободно плавают или опускаются на дно, они переносят замораживание и высыхание. Высохшие эфиппии разносятся ветром. Тепло и влага пробуждают яйца к жизни; из них выводятся самки, способные в течение многих поколений размножаться без самца.

Критерии выбора тест - объекта в токсикологических исследованиях

Имеющаяся на данный момент информация о Daphnia magna позволяет заключить, что представители этой группы животных соответствуют большинству критериев, по которым выбираются тест – объекты для биотестирования, так как:

- способны накапливать загрязняющее вещество и не погибают под действием встречающихся в природе концентраций;

- имеется много видов Daphnia magna, легко доступных в природе;

- имеют приемлемые размеры;

- легко культивируются в лабораторных условиях;

- образ жизни хорошо изучен;

- имеют короткий жизненный цикл развития.

Daphnia magna отвечают также требованиям к индикационным видам беспозвоночных животных, используемых в биологическом мониторинге водной среды:

- по своей экологии заметно подвергаются воздействию тех веществ среды, на которые ориентирован мониторинг;

- занимают функционально значимое место в экосистемах всех регионов;

- широко распространены во всех областях;

- заметно реагируют на изменение среды колебаниями численности.

Поэтому в дополнение к их важной роли в экологии водных сообществ, Daphnia magna представляют собой подходящие организмы для токсикологических исследований.

Изложенное выше свидетельствует, что Daphnia magna представляют интерес и являются перспективными объектами для разработки системы биотестирования природных вод.

Условия культивирования (и биотестирования) дафний.

        Культуру дафний выращивают в стеклянной посуде вместимостью до 2 дм3. Посуду моют питьевой содой и тщательно ополаскивают дистиллированной водой. Нельзя применять синтетические моющие средства и органические растворители.

        Для культивирования дафний используют питьевую воду. Питьевую воду предварительно дехлорируют путем отстаивания и аэрируют микрокомпрессором до достижения концентрации растворенного кислорода не менее 6 мг/дм3.

        Начальная плотность культуры дафний должна быть от 10 до 15 особей в 1 дм3. Один раз в неделю взрослых дафний в возрасте до 4 недель и молодь (для дальнейшего поддержания культуры) пересаживают отдельно в посуду со свежей водой.

        Пересаживают дафний при помощи стеклянной трубки внутренним диаметром 5-7 мм так, чтобы их не травмировать. Для этого конец трубки помещают под поверхность воды и держат до тех пор, пока дафнии не перейдут в трубку. Аэрировать воду в посуде с дафниями не рекомендуется.

        Дафний кормят один раз в сутки суспензией зеленых водорослей и один раз в неделю - суспензией хлебопекарных дрожжей.

        Для приготовления дрожжевого корма 1 г свежих или 0,5 г воздушно-сухих дрожжей заливают 100 см3 дистиллированной воды. После набухания дрожжей суспензию тщательно перемешивают и отстаивают в течение 30 мин. Надосадочную жидкость добавляют в посуду с дафниями в количестве 5 см3 на 1 дм3 воды.        

        В качестве водорослевого корма для дафний рекомендуется использовать зеленые протококковые водоросли - сценедесмус или хлореллу.

        Водоросли вносят в культуру дафний из расчета 1 см3 суспензии водорослей (плотность клеток составляет примерно 350 млн.кл/см3). Суспензию водорослей получают центрифугированием или отстаиванием в холодильнике в течение 2-3 суток. Надосадочную жидкость сливают, а осадок разбавляют в 2 раза дистиллированной водой и используют в качестве корма.

         Для биотестирования используют дафний в возрасте до 24 ч, которых кормят за 2-3 ч до начала биотестирования. Чтобы получить необходимое количество тест-объектов для биотестирования, 20-30 самок дафний с выводковыми камерами, полными яиц или зародышей, за одни сутки до биотестирования пересаживают в стеклянную посуду емкостью от 0,5 до 1,0 дм3 с водой для культивирования и вносят корм. После появления молоди (каждая самка может выметать от 10 до 40 молодых дафний) взрослых особей удаляют.

Проведение биотестирования.

        При биотестировании выполняют следующие операции.

1. Пробу воды наливают в стеклянные сосуды по 100 см3 (опыт). Другие сосуды наполняют таким же объемом отфильтрованной воды из емкостей, где культивируются дафнии (контроль). Повторность в опыте и контроле трехкратная.

2. В каждый опытный и контрольный сосуд помещают по 10 дафний в возрасте до 24 ч. Их быстро переносят стеклянной трубкой диаметром 5-7 мм, погрузив ее в воду.

3. Продолжительность биотестирования составляет 96 ч. Во время биотестирования дафний не кормят.

4. В конце биотестирования визуально подсчитывают количество живых дафний. Живыми считают дафний, которые свободно передвигаются в толще воды или всплывают со дна сосуда не позже, чем через 15 сек после его легкого встряхивания. Остальных дафний считают погибшими.

Обработка и оценка результатов.

1. На основании результатов трех параллельных определений количества живых дафний в контроле и опыте находят средние арифметические количества живых дафний в контроле (опыте).

        Рассчитывают в процентах количество погибших дафний в опыте по отношению к контролю.

2. Вывод о наличии или отсутствии острой летальной токсичности пробы воды  делают на основании величины: гибель  50% дафний и более-  анализируемая проба проявляет острую летальную токсичность.

3. Результаты учета выживаемости и плодовитости тест-объектов в ходе опыта заносят в таблицу:

 4. Оценка результатов теста. Вода признается нетоксичной, если ни в одной серии опытов не отмечено нарушений поведения тест-объектов или достоверных отклонений показателей смертности/плодовитости по сравнению с контролем.

Результаты исследования и их анализ

Результаты биотестирования представлены в Приложении 2  в таблице 1.

Как видно из приведенных данных (Приложение 3, диаграмма 1), при кратковременном биотестировании (до 96 часов), которое позволяет определить острое токсическое действие воды, выживаемость дафний в тестируемых пробах не изменилась. Показателем выживаемости служит среднее количество тест – объектов, выживших в тестируемой воде или в контроле за определенное время. Критерием токсичности является гибель 50% и более процентов дафний за период времени до 96 часов в тестируемой воде по сравнению с контролем. Отсюда можно сделать вывод, что исследуемая вода не оказывает острого токсического действия на тест – объект.

Статистическая обработка результатов длительного тестирования (28 суток), которое позволяет определить хроническое токсическое действие воды на дафний по снижению их выживаемости и плодовитости, в течение которого было получено от исходных самок три помета, позволяет заключить (Приложение 3, диаграмма 2), что анализируемая вода хроническим токсическим действием не обладает.

Выводы

В ходе проведенного исследования были изучены экологические особенности жизнедеятельности Daphnia magna, освоена методика проведения биотестирования и достигнута цель работы – установлена степень токсичности природной воды.

Биотестирование воды с Белгородского водохранилища, проведенное  с использованием в качестве тест – объекта Daphnia magna, позволяет заключить, что анализируемая вода не обладает острым и хроническим токсическим действием.

Использование биотестирования показало, что данный метод мониторинга окружающей среды отличается простотой, оперативностью и доступностью, поэтому должно получить широкое признание.

Биотестирование наиболее перспективный метод мониторинга окружающей среды, который в дальнейшем будет развиваться. Наиглавнейшей задачей данного вида исследования является поиск новых тест – объектов, которые бы позволили делать выводы о качестве природной воды в более короткие промежутки времени, чем с использованием Daphnia magna.

Использованная литература и интернет - источники:

Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных (критический обзор) // Гидробиол. журн. - 2000. - Т. 36, N 5. - С. 50-70.

Дятлов С.Е. Роль и место биотестирования в комплексном мониторинге морской cреды // Экология моря. - 2000, вып.51. - С. 83-87.

Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. - Черноголовка, 1988. - С. 4-14.

Кузьменко М.И.,Брагинский Л.П., Ковальчук Т.В., Романенко А.В. Гидроэкологический русско-украинско-английский словарь-справочник. - К.: "Демиур", 1999. - 262 с.

Онегов А. Школа юннатов. Живой уголок/Худож. В. Ра-даев, В. Храмов. - М.: Дет. лит., 1990. - 271 с.: ил.

Семенченко В.П. Принципы и системы биоиндикации текучих вод. – Минск: "Орех", 2004. – 125 с.

http://www.microbiotests.be/

Приложение 1

Фото самки Daphnia magna.

Приложение 2

Таблица 1

Результаты учета выживаемости и плодовитости тест-объектов

Приложение 3

Диаграмма 1

Диаграмма 2