Ведение в культуру in vitro семян рябины

Научно-практическая конференция школьников «Эврика»

Секция: Биология

Введение в культуру in vitro семян рябины

Автор:  Лукоянова Полина Александровна

МБОУ «Кольцовская школа № 5», 11 класс

руководитель: к.б.н. Зайцева Юлианна Геннадьевна

консультант: Трубенкова Татьяна Ивановна,

учитель биологии высшей квалификационной категории

контактный телефон: 8 952935 9631

Новосибирск, 2023

Содержание

Введение:        3

Методы исследования:        6

Результаты:        7

Вывод:        9

Список использованных источников:        12

1. Введение:

Красный список Международного союза охраны природы и природных ресурсов (МСОП), включающий перечень видов, статус их редкости, ареалы, является важнейшим показателем состояния биологического разнообразия в мире ,и одновременно, служит мощным инструментом действий по его сохранению. Рябина судетская Sorbus sudetica (далее S .sudetica ) ресурсный вид, внесенный в Красный список МСОП, относящейся к категории «под угрозой исчезновения».

S. sudetica – в периоде произрастает только в горном массиве Крконоше в Чехии. Природная популяция S. sudetica находиться в критическом состоянии и на данный момент насчитывается около 100 особей. Местообитание S .sudetica располагается на территории биосферного заповедника из списка UNESCO. По данным UNESCO, уникальный горный массив Крконоше является своего рода экологическим островом арктической и альпийской экосистем. Климат Крконоше довольно суровый, характеризуется частыми изменениями погоды. Зимы с глубоким снежным покровом в течение пяти или шести месяцев. Данный обстоятельства позволяют использовать высокогорные растения Крконоше для выращивания в северных регионах России.

Рябина судетская внесена в международную Красную книгу и нуждается в сохранении.  Семенное размножение этого вида рябины неэффективно, поскольку семена обладают глубоким покоем и в следствии низкой всхожестью. Наиболее перспективный способ сохранения – введение в культуру in vitro, с целью сохранения и размножения. По имеющимся литературным данным, такой способ размножения этого вида рябины, не был разработан ранее.  В природе S. sudetica кустарник высотой от 50 до 300 см с крупными съедобными плодами. Темп роста средний. Цветет в июне. Плодоносит с 8 лет, плоды созревают в сентябре. Всхожесть семян 60%. Черенки укореняются слабо. В условиях культуры ботанического сада S. sudetica успешно произрастает с 2009г, достигает высотой 80 см, регулярно цветет и плодоносит.  Преимуществом микроклонального размножения является:

• получение генетически однородного посадочного материала (клонов);
• освобождение растений от вирусов;
• высокий коэффициент размножения;
• сокращение продолжительности селекционного процесса;
• ускорение перехода растений от фазы роста и развития до репродуктивной фазы развития;
• размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
• возможность проведения работ в течение всего года;
• возможность автоматизации процесса выращивания.

Клональное микроразмножение включает в себя: выбор растения-донора, изолирование эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры. Сам процесс микроразмножение - получение максимального количества меристематических клонов. Укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле, от этого этапа зависит успех клонального микроразмножния.

Существует много методов клонального микроразмножения, а также различных их классификаций. Согласно одной из них, предложенной Мурасиге в 1977 году, процесс можно осуществлять следующими путями:

• Активация пазушных меристем
• Образование адвентивных побегов тканями экспланта
• Возникновение адвентивных побегов в каллусе
• Индукция соматического эмбриогенеза в клетках экспланта
• Соматический эмбриогенез в каллусной ткани
• Формирование придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей (деление первичных эмбриоидов).

Для сохранения вида используют способ активации пазушных меристем под действием ауксинов и цитокининов.

Ауксины — гормоны роста, стимулирующие деление клеток, а также укоренение растений. Цитокинины – гормоны, которые стимулируют деление клеток растения, участвуют в развитии растений и стимулируют ветвление побега. Вместе обеспечивают стимуляцию роста растений.

Цель: исследовать влияние ауксинов и цитокининов на семена Рябины судетской и разработать технологию сохранения Sorbus sudetica in vitro.

Задачи: 

1. получить стерильный материал Sorbus sudetica из Центрального сибирского ботанического сада;
2. подготовить питательные среды с разной концентрацией ауксинов и цитокининов;
3. укоренить микропобеги  Sorbus sudetica;
4. оценить коэффициент размножения Sorbus sudetica;

2. Методы исследования:

1. Приготовление питательной среды:

Питательные среды готовили по прописи Мурасиге и Скуга (МС) с разной концентрацией цитокининов и ауксионов (2:1,5:1). Для ее приготовления в дистиллированную воду добавлялись сахароза, витамины, микро- и макроэлементы, и агар-агар. Дальше мы измерили ее кислотность (pH) и довели ее до 5,8. Затем она прошла автокловирование и после охлаждения в нее добавляли регуляторы роста (ауксины и цитокинины) 2,5 мг/л бензоаминопурин (БАП) и 1 мг/л индолилмасляную кислоту (ИМК) соответственно.

2. Микроразмножение:

Исходные  микропобеги (рис.1) высаживали на среду для размножения с выше указанной концентрацией ауксинов и цитокининов, затем экспланты высаживали в 3 банки по 5 штук, экспланты культивировали 8 недель под световыми лампами (рис.2). После этого подсчитывали количество побегов на эксплантах и их высоту.(рис.6) Эксперимент повторили трижды. Высчитали коэффициент размножения рябины (рис.3)

3. Укоренение:

Питательную среду приготовили по той же технологии, что и в п.1 только с уменьшенным вдвое минеральным составом (½ МС) и дополненной 0,1 мг/л ИМК.  Микропобеги полученные в результате микроразмножения помещали горизонтально на среду для укоренения и культивировали в течение 8 недель, после чего подсчитывали процент микропобегов, образовавших корни.

Все работы, связанные с микропобегами проводились в ламинаре, в стерильных условиях.

3. Результаты:

Для создания технологии конального микроразмножения данного вида рябины был получен стерильный материал из Центрального сибирского ботанического сада: стерильные микропобеги в культуральных сосудах на питательной среде. Вегетативное размножение в культуре in vitro стимулируют с помощью добавления в питательную среду регуляторов роста растений: ауксинов и цитокининов. Ауксины — гормоны роста, стимулирующие деление клеток, а также укоренение растений. Цитокинины – гормоны, которые стимулируют деление клеток растения, участвуют в развитии растений и стимулируют ветвление побега. Вместе обеспечивают стимуляцию роста растений.

В нашем эксперименте при испытании двух сред оказалось, что среда, содержащая 5 мг/л цитокинина БАП и 1 мг/л аксина ИМК позволили получить около 2-х побегов на эксплант. Ветвление происходило за счет активации пазушных почек. Среда, содержащая 2 мг/л БАП не вызвала ветвления побегов и была не эффективна (рис. 2). Таким образом с повышением концентрации цитокинина в питательной среде возрастает коэффициент размножения Рябины судетской.

Высота побегов – важный показатель для успешного укоренения побегов in vitro. Оптимальной высотой считается высота около 10 мм. Максимальная высота полученных нами побегов составила 12 мм на среде, содержащей 5 мг/л БАП и с повышением концентрации цитокинина этот показатель, снижался (рис 4). На среде оптимальной для размножения, высота побегов оставила чуть более 10 мм. Этой высоты достаточно для дальнейшего укоренения микропобегов.

Анализируя полученные данные о коэффициенте размножения и высоте микропобегов можно сказать, что наиболее эффективной из испытанных вариантов питательных сред для размножения является среда, содержащая 5 мг/л БАП и 1 мг/л ИМК

        Для укоренения микропобеги помещал на среду без регуляторов роста и с ауксином – ИМК в концентрации 0,1 мг/л. В ходе экспериментов установлено, что в среде, содержащей ауксин, рябина пустила корни, т.е. происходил ризегенез, без добавления аксинов корни не образовывались. Однако на среде с ИМК только у 15% всех микропобегов образовались корни. Это невысокий результат, поэтому этап укоренения рябины нуждается в оптимизации. Это работа запланирована нами в дальнейшем. Полученные укорененные растения будут в дальнейшем адаптированы к нестерильным условиям и высажены в открытый грунт.

4. Вывод:

Таким образом, нам удалось сохранить сорт этой рябина в коллекции in vitro, разработать технологию клонального микроразмножения Рябины судетской, которую в последующем можно пересаживать в открытый грунт. Можно сказать, что нам удалось разработать технологию сохранения Sorbus sudetica in vitro.

Рис.1 Микропобеги до начала эксперемента

рис.2 Микропобеги после культивирования

рис.3 Коэффициент размножения Рябины судетской

рис.4 Результат введения в среду

рис.5 Результаты введения в среду для укоренения

рис.6 Высота микропобегов рябины в зависимости от содержания БАП и ИМК в среде

5. Список использованных источников:

1. Методы микроклонального размножения [Электронный ресурс]- режим доступа:  https://microklon.ru/page/metody-mikroklonalnogo-razmnozhenija
2. Микроклональное размножение растений [Электронный ресурс]- режим доступа: https://apexland.ru/tekhnologiya/ 
3. Микроклональное размножение растений [Электронный ресурс] - режим доступа: https://gummi.ru/services/363/ 
4. Фитогенетика [Электронный ресурс] - режим доступа: http://fitogenetika.ru/articles.html/id/10