Тропизмы растений

Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение лицей имени дважды Героя Социалистического Труда В. Ф. Резникова муниципального образования Каневской район

Тема проекта:

«Генотипирование растений»

Работу выполнил

ученик 11 «Б» класса

                                                                             Заболотнев Роман Сергеевич

Руководитель:

Базалий Алина Сергеевна 

                                                        2023 г.

Содержание

Введение…………………………………………………………………………...3

Теоретическая часть………………………………………………………………5

Суть метода………………………………………………………………………..8

Практическая часть ……………………………………………………………..10

Заключение………………………………………………...……………………..14

Список использованных источников………………………………………...…15

Введение

Определение и идентификация видов имеет большое прикладное значение. Отнесение того или иного организма к определённому виду становится основой к достижению многих целей, поставленных ЦУР.

Так, идентификация и описание видов помогает нам оценить разнообразие промысловых животных и растений, что может стать фундаментом для обеспечения продовольственной безопасности и улучшения пищевой промышленности (соответствует цели номер 2 ЦУР).

Кроме того, это позволяет вовремя заметить сокращение разнообразия видов в популяциях и предотвратить их исчезновение (соответствует цели номер 15 ЦУР).

Почему важно идентифицировать организмы генотипически?

Вспоминая про половой диморфизм и жизненные циклы, становится очевидным, что не все представители одного вида будут выглядеть одинаково. По этой причине появились определители видов, но работа с ними также является достаточно трудоемкой и результаты не всегда могут быть корректны.

Однако благодаря методам молекулярно-генетических исследований, мы имеем возможность идентифицировать организмы на основе генотипирования. На сегодняшний день такой способ идентификации является наиболее оптимальным.

Рис является основной культурой в Азии, именно поэтому важно знать его подвиды и виды для изучения и последующего генотипирования.

Актуальность: морфологические признаки не являются достоверными данными для определения растений, поэтому следует изучить возможность генотипирования растений. Актуальными являются проблемы подбора универсальных ДНК-штрихкодов для многих видов растений, которые поиска маркеров для идентификации конкретных подвидов и сортов.

Цель: изучение ДНК-штрихкодов для объяснения не скрещиваемости разных подвидов риса.

Задачи:

1. Изучение литературы и интернет источников
2. Проведение практической части
3. Изучение результатов

Предмет исследования: скрещиваемость подвидов риса.

Объект исследования: ДНК-штрихкоды.

Гипотеза: проведение опытов ПЦР и электрофореза позволяет определить наличие ДНК.

Теоретическая часть

ДНК-Штрихкодирование - метод молекулярной идентификации, который позволяет по коротким генетическим маркерам в ДНК определять принадлежность организма к определённому таксону. Уникальный днк-штрихкод - это такая последовательность нуклеотидов, которой соответствует только 1 вид растения. Значит, не уникальному днк-штрихкоду соответветствуют несколько видов растений.

Таким образом, мы разделили полученные виды на 2 группы. Первая группа включает в себя виды, которым соответствуют уникальные днк-штрихкода, вторая - виды, которым соотвествуют не уникальные днк-штрихкода.

 Потребности в безошибочной идентификации с точностью до вида или рода образцов живых растений в природе или видовой принадлежности продуктов растительного происхождения в науке и на практике не удовлетворяются ввиду нехватки опытных экспертов.

Поэтому области применения ДНК-штрихкодирования в ботанике и экспертной службе весьма разнообразны. В науке это идентификация трудно определяемых видов (например, коротко- и редко цветущих, особенно древесных), более точное определение видового состава локальных флор и растительных сообществ, выявление новых видов.

Поиск универсального ДНК-штрихкода растений оказался довольно сложной задачей. Одного участка (или комбинации из участков), по которому можно было бы определить конкретный вид или подвид, не было выявлено.

Хотя обычно комбинация, рекомендованная в 2009 г. как стандарт (rbcL + matK+ITS), позволяет отнести вид к определенному роду. Вариативность отдельных маркеров не одинакова в разных таксономических группах, что, как правило, позволяет подобрать ДНК-штрихкод (иногда даже укороченный мини-штрихкод) для конкретной группы, особенно в случае задач прикладного характера.

В настоящее время наиболее распространенным методом идентификации сортов риса indica и japonica является “индекс Чена”, который исследует шесть ключевых признаков образцов риса:

(1) волосатость леммы,

(2) реакция фенола в зернах риса,

(3) длина между узлами осей метелок,

(4) цветшелуха зерна,

(5) волосатость листовых пластинок

(6) соотношение длины / ширины зерен.

Однако на эти морфологические и физиологические признаки может сильно повлиять изменение условий окружающей среды.

Как следствие, конечные результаты одних и тех же образцов риса, полученных в разных условиях окружающей среды, могут значительно различаться, что влияет на точность и согласованность идентификации indica и в japonica разных регионах.

Кроме того, необходимо измерить соответствующие признаки зрелых растений риса, когда используется этот морфологический метод идентификации indica и japonica.

Таким образом, получение результатов отнимает много времени. Как правило, измеренные образцы (семена) должны быть выращены в полевых условиях, и требуется минимум 3-4 месяца (от посева семян до сбора зрелых растений), чтобы исследованные образцы были готовы к измерению.

Кроме того, измерение на основе морфологии требует минимального размера выборки с достаточным количеством рисовых растений, что приведет к использованию большого количества рисовых материалов для идентификации, что приведет к ненужному разбазариванию.

Вышеупомянутые недостатки традиционного метода индекса Чена значительно ограничили его широкое применение для идентификации риса индики или японской культуры.

Для определения принадлежности к подвидам indica и japonica используются 34 эффективных InDel маркеров.

Для определения растения риса к какому-либо подвиду, надо провести ПЦР и электрофорез, а далее изучить полученные результаты.

Суть метода

Всe мы знаeм, что ДНК — этo двухцепoчечная мoлекула, где каждая цепочка состоит из нуклеотидов. Нуклеoтиды сoстаят из трeх молекул: oстатка фосфорной кислоты, сахара и азoтистого oснования.

Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК, то азотистых оснований четыре: аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г сooтветственно.

В этих мoлекулах РНК, тимин заменен урацилом. Нуклеoтиды соединяются в длинную цепочку, создавая связи между фoсфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого.

В результате чего на одном конце каждой цепи ДНК присутсвует фосфатная группа (5ˊ-конец), а на другом — гидроксильная (3ˊ-конец).

Две цепи расположены в мoлекуле ДНК антипараллельнo, тo есть напротив 3ˊ-конца одной находится 5ˊ-конец другой.Для того чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействoвать друг с другом.

Это обеспечивают вoдорoдные связи, образующиеся между азoтистыми основаниями противоположных цепeй по принципу комплемeнтарности: А сoединяется только с Т (или У в РНК), а Г — с Ц. И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.

Типичная реакционная смесь:

Анализируемая ДНК. Этo мoжет быть как отдельный кусoчек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.

Праймеры.

Праймер — это искусственно синтезированная короткая цепoчка нуклеотидов длинною 20-25 штук, комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК.

Один из праймеров обычно сoответствует началу амплифицируемогo oтрезка, другой — его кoнцу, но на противополoжной цепи. У праймеров, есть свои 3ˊ- и 5ˊ-концы.

Нуклеoтиды.

ДНК-полимераза - это фермент, стрoящий комплементарную матричной цeпь ДНК. Oн может начинать синтeз толькo oт 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термoстабильные полимеразы.

Буфер.

Раствoр, содержащий иoны для пoддержания нужнoгo рН, соли магния, необхoдимые для работы полимеразы. Все компоненты смешивают в нужном объеме деионизованной воды в специальных пробирках для ПЦР и помещают в амплификатoр (или ПЦР-циклер)

Практическая часть

Этапы реакций

Цель ПЦР — получить множество одинаковых двухцепочечных кусочков ДНК строго определенной длины (обычно не более 2–3 тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). Для этого проводят 20–30 циклов реакции.

Каждый цикл состоит из трех этапов:

1. Денатурация

Для того чтобы полимераза могла работать, две цепи ДНК-матрицы нужно разъединить. Для этого реакционную смесь нагревают до 94–98 °С. В таких условиях разрушаются водородные связи между азотистыми основаниями параллельных цепей.

2. Отжиг праймеров

На этом этапе праймеры специфично присоединяются к освободившимся цепям ДНК-матрицы с разных сторон копируемого участка 3ˊ-концами друг к другу.

Чтобы праймеры могли комплементарно связаться (отжечься) только с нужными участками, при их конструировании необходимо учитывать такую важную характеристику, как температура плавления (Тm).

Это расчетная температура, при которой половина праймеров присоединяется к целевому участку ДНК. Отжиг проводят при температуре на 1–5 °С ниже Tm, но не выше оптимальной температуры работы полимеразы, то есть в пределах 40–72 °С.

В идеале праймеры должны соответствовать следующим критериям: температуры плавления двух праймеров не должны различаться более чем на 5 °С; в структуре олигонуклеотидов не должно быть шпилек (участков, комплементарных друг другу);

В реальности редко получается соблюсти все условия из-за множества причин. Однако чем больше критериев соблюдено при создании праймеров, тем выше вероятность правильной их работы.

Чтобы разработать эффективные праймеры, необходимо знать последовательность ДНК у концов целевого участка, и, руководствуясь упомянутыми критериями, выбрать подходящие фрагменты, которым будут комплементарны будущие праймеры. Всё это удобно делать в специальных компьютерных программах — например, PrimerSelect.

3. Элонгация, или синтез ДНК

Полимеразная эта реакция от того, что в ее ходе фермент ДНК-полимераза последовательно выстраивает цепь ДНК (полимер) из нуклеотидов (мономеров), то есть полимеризует их. И делает она это на третьем этапе ПЦР.

Этот этап чаще проводят при температуре 72 °С — оптимальной для работы Taq-полимеразы. Фермент присоединяется к комплексам праймер—матрица и, выхватывая из раствора нуклеотиды, начинает по принципу комплементарности прилаживать их к 3ˊ-концу праймера.

Удлинение, или элонгация, новой цепи ДНК идет с максимальной скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду (то есть около 3000 в минуту). Однако при программировании ПЦР-циклера задают время с запасом: по минуте на каждую тысячу пар нуклеотидов.

Каждая вновь синтезированная цепочка ДНК становится, наравне со старой, матрицей для синтеза в следующем цикле. Таким образом, количество нужного продукта в процессе реакции возрастает экспоненциально.

После прохождения всех циклов в реакционной смеси образуется столько специфических двухцепочечных продуктов, что их «массив» можно увидеть невооруженным глазом — проведя гель-электрофорез, о котором расскажем ниже.

К сожалению, экспоненциальная амплификация не может длиться вечно. Через 25–30 циклов количество функциональных молекул полимеразы в реакционной смеси истощается. Но чтобы добиться еще большего выхода продукта, содержимое пробирки можно разбавить, например, в 1000 раз и снова использовать для амплификации с уже новыми рабочими компонентами.

Практическая часть проходила в 2 этапа: на базе ВГАУ и на базе ПИМУ.

В ВГАУ мы изучили real time ПЦР и электрофорез. На базе ПИМУ мы провели ПЦР и электрофорез.

Проведение электрофореза:

1. Подогреть агарозу с буфером до полного растворения (мутное расслоение как при смешивании чая с сахаром должно пропасть). Смесь не должна вскипеть, но должна кипеть как вода, пенится. Пена должна уйти.

2. Остудить так, чтобы можно было рукой спокойно трогать.

3. Добавить бромистый этидий в гель до концентрации 0,2 мкг/мл (на 100 г: от 2 до 10 мкл. Чем больше, тем лучше видно. Примерно 4 можно). Ядовит, добавлять в перчатках.

4. Разлить в собранную закрепленную форму.

5. Вставить гребёнку.

6. Дать остыть (30-60 мин).

7. Снять боковые ограничители.

8. Положить в ванночку, учитывая положение электродов.

9. Вынуть гребёнку, поднимая её строго вверх (подложку оставить в ванночке).

10. Электроды: ДНК идёт от - к +.

11. Проведение электрофореза: капнуть в 1 лунку разграничитель (днк-лестницу).

12. Капнуть в лунки другие образцы.

13. Напряжение: 2 В/см (см между электродами) (чётко) 5В/см – оптимум 6 В/см (нечетко, т.к. греется и гель плывёт)

                                                      Заключение

В ходе работы мы изучили литературные источники, выяснили, что ДНК-Штрихкодирование - метод молекулярной идентификации, который позволяет по коротким генетическим маркерам в ДНК определять принадлежность организма к определённому таксону.

Уникальный днк-штрихкод – это последовательность нуклеотидов, которой соответствует только 1 вид растения. Значит, не уникальному днк-штрихкоду соответветствуют несколько видов растений.

В настоящее время наиболее распространенным методом идентификации сортов риса indica и japonica является “индекс Чена”, который исследует шесть ключевых признаков образцов риса: волосатость леммы, реакция фенола в зернах риса, длина между узлами осей метелок, цветшелуха зерна, волосатость листовых пластинок, соотношение длины / ширины зерен.

Таким образом, мы выяснили причину не скрещиваемости разных подвидов риса, вспомнили подробное строение двухцепочечной молекулы- ДНК, выяснили, что из себя представляет ДНК-штрихкод, узнали порядок проведения ПЦР, а также что происходит при генотипировании.

Для определения принадлежности к подвидам indica и japonica используются 34 эффективных InDel маркеров.

Для определения растения риса к какому-либо подвиду, надо провести ПЦР и электрофорез, а далее изучить полученные результаты.

Список использованных источников:

1. https://boldsystems.org/
2. https://www.researchgate.net/publication/333386292_DNK-strihkodirovanie_metody_i_podhody
3. http://wwwimb.dvo.ru/misc/barcoding/files/Shneyer_Rodionov_(Ru)_2018.pdf
4. https://elementy.ru/genbio/synopsis/246/DNK_shtrikhkodirovanie_vidov_zhivotnykh_i_rasteniy_sposob_ikh_molekulyarnoy_identifikatsii_i_izucheniya_bioraznoobraziya
5. https://biomolecula.ru/articles/metody-v-kartinkakh-polimeraznaia-tsepnaia-reaktsiia
6. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S100200710900207X#tbl5